肉座菌目真菌糖基转移酶-甲基转移酶模块生物催化酚类药物先导化合物的分子机制

Glycosylation and methylation endow many natural products with their water solubility and biological activity. Biological glycosylation and methylation offer regiospecificity not readily obtainable by chemical methods, and promises easy scalability in an environmentally sustainable manner. Development of biological glycosylation demands the identification of promiscuous but regiospecific enzymes, and the generation of efficient synthetic biology platforms. Based on the previous identification of 5 Hypocreales fungal glycosyltransferase-methyltransferase（GT-MT）modules capable of attaching a methylglucose to drug-like phenolic small molecules, the GT-MT modules with high biotransformation efficiency and region-specificity to the phenolic drug-like molecules will be screened among the natural GT-MT modules and the recombinational GT-MT modules by heterogeneous expression in Saccharomyces cerevisiae, substrate feeding and chemical biological analysis. By modeling the protein structure and the interaction with docked donor and acceptor substrates, replacing the key amino acids, and elucidating the chemical structures, the molecular mechanism of regiospecific glycosylation to phenolic drug-like molecules with fungal glycosyltransferases from Hypocreales will be revealed. The results of this project will contribute to the engineering design of glycosyltransferase, and provide theoretical and practical value for the development of synthetic biology platform to modify drug-like molecules.

糖基化和甲基化可提高药物分子的生物有效性。和化学方法相比，生物糖基化和甲基化具有区域选择性催化的优点，且环境友好。应用生物方法对药物分子糖基化和甲基化，不仅需要发现底物范围广且具有区域选择性的酶，而且还需要开发相应的高效合成生物学平台。在前期研究中，我们首次发现了5对能够催化酚类药物先导化合物甲基糖基化的肉座菌目真菌糖基转移酶-甲基转移酶模块编码基因，本项目拟通过酿酒酵母异源表达、底物饲喂和化学生物学分析，比较天然模块和重组模块对酚类药物先导化合物的转化效率，筛选出对特定底物高效区域选择催化的糖基转移酶-甲基转移酶模块。通过对糖基转移酶的同源建模和与底物互作模拟、氨基酸定点替换和催化产物结构解析，阐明肉座菌目真菌糖基转移酶区域选择催化酚类药物先导化合物的分子机制。本项目的研究结果有助于工程化设计糖基转移酶，对于建立高效修饰药物分子结构的合成生物学平台具有理论和应用价值。

酚类药物分子的糖基化和甲基化修饰是改善其生物有效性的重要手段。酶催化的糖基化和甲基化反应具有转化率高、区域选择性专一等优点。因此，挖掘底物谱宽泛、具有区域选择性的糖基转移酶和甲基转移酶对生物合成重要酚类药物分子至关重要。本项目通过基因组挖掘自肉座菌目真菌中发现5组新型糖基转移酶-甲基转移酶模块。在酿酒酵母中异源表达后发现，所有模块都能甲基糖基化7种结构类型不同的酚类化合物，其中来自玫烟色棒束孢的IfGT-IfMT模块具有最高的催化效率和独特的区域选择性。甲基糖基化修饰能够明显改善天然黄酮山奈酚的水溶性，并提高其杀虫活性。对5组糖基转移酶-甲基转移酶模块进行拆分和重组，构建8种重组糖基转移酶-甲基转移酶模块发现BbGT-IfMT模块对山奈酚的整体转化率达到94%，高于天然的BbGT-BbMT模块。但是，CmGT-BbMT对山奈酚的整体转化率比天然模块CmGT-CmMT降低了27%。说明重组糖基转移酶-甲基转移酶模块的催化活性会受不同的糖基转移酶和甲基转移酶组合影响。另外，肉座菌目糖基转移酶-甲基转移酶模块的区域选择性由糖基转移酶单独控制，异源甲基转移酶对区域选择性没有影响。三维结构和分子对接模拟结果显示5种肉座菌目真菌糖基转移酶的整体结构非常相似，但是催化腔室上方由一段-螺旋和无规则卷曲构成的“盖子”结构具有显著的构象差异。通过多肽片段交换和氨基酸定点突变构建了6种糖基转移酶突变体，从而证实了“盖子”结构上的氨基酸残基是控制肉座菌目真菌糖基转移酶区域选择性糖基化的关键位点。以上研究结果阐明了肉座菌目真菌糖基转移酶区域选择催化山奈酚糖基化的分子机制，为利用合成生物学平台高效甲基糖基化酚类药物分子提供了功能模块，为工程化设计糖基转移酶提供了新思路。项目执行过程中培养博士研究生2名，硕士研究生3名，发表SCI收录学术论文10篇，授权发明专利3项。项目负责人在第三届中国药品安全技术大会暨第四届生物安全论坛等会议汇报相关研究工作，邀请美国亚利桑那大学Istvan Molnar教授来华分享和交流相关研究进展，并合作发表文章。