阿霉素所致心肌细胞凋亡中SIRT1介导的HSP25蛋白去乙酰化位点解析与功能研究

阿霉素的心脏毒副作用是肿瘤患者临床化疗过程中亟待解决的问题。热休克蛋白25（HSP25）是心肌细胞含量丰富的伴侣蛋白，具有抵抗心肌损伤的作用。我们前期研究发现SIRT1介导的HSP25去乙酰化可以减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。为深入探讨此现象的内在机制，本项目将首先分析阿霉素诱导的心肌HSP25蛋白乙酰化修饰的变化模式，并分析HSP25蛋白的乙酰化与磷酸化的关系，然后通过证明HSP25与去乙酰化酶SIRT1的相互作用，探讨HSP25去乙酰化修饰的调控；最后通过突变体的构建研究HSP25氨基酸肽链哪些（个）赖氨酸位点可以被乙酰化修饰；哪些（个）位点赖氨酸的突变将影响HSP25的抗凋亡功能等几个方面的研究解析SIRT1介导的HSP25乙酰化修饰位点及其对阿霉素所致心肌细胞凋亡的影响。

【目的】我们在前期研究工作中发现，阿霉素可导致心肌细胞HSP25的乙酰化修饰程度增加，细胞凋亡增加，因此推测HSP25的乙酰化修饰改变可能参与了阿霉素所致心肌细胞凋亡的发生，调控HSP25的乙酰化水平将能够抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。本课题通过研究阿霉素诱导的HSP25乙酰化修饰变化模式及其与磷酸化修饰的关系；HSP25是否能够与SIRT1的相互作用及其去乙酰化修饰的调控机制；解析HSP25蛋白肽链乙酰化修饰的赖氨酸位点及可乙酰化修饰的赖氨酸位点发生突变是否影响HSP25的功能等科学问题，初步阐明HSP25乙酰化修饰对阿霉素所致的心肌细胞凋亡的影响及其调控机制。..【方法和结果】首先，在细胞和整体动物水平，通过western blot检测发现经阿霉素处理后H9c2心肌细胞、阿霉素组Balb/c小鼠心脏组织及阿霉素组新西兰兔心脏组织，HSP25蛋白乙酰化水平分别升高了37.0%、41.7%和38.3%；采用磷酸化特异性抑制剂CMPD1对阿霉素所致HSP25蛋白的高磷酸化进行干预，发现阿霉素所致HSP25蛋白高磷酸化受到抑制后，阿霉素所致的HSP25蛋白高乙酰化未发生明显改变；通过构建HSP25真核表达载体结合免疫共沉淀技术，发现HSP25蛋白能够与SIRT1蛋白发生相互作用；去乙酰化酶SIRT1的抑制剂Sirtinol和Splitomicin及采用RNA干扰技术抑制SIRT1蛋白的表达，HSP25蛋白均可发生高乙酰化修饰，证实HSP25的乙酰化修饰受SIRT1的调控。采用质粒瞬时转染及RNA干扰技术，发现HSP25蛋白介导了SIRT1对p53蛋白的去乙酰化修饰。最后，采用定点突变技术发现HSP25蛋白127位赖氨酸为其乙酰化修饰位点；将HSP25蛋白的127位赖氨酸突变为精氨酸，可促进阿霉素所致的H9c2心肌细胞凋亡。..【结论】（1）HSP25能够被乙酰化修饰。阿霉素导致心肌细胞损伤时，HSP25乙酰化水平升高；（2）抑制HSP25的磷酸化未能影响其乙酰化修饰过程；（3）HSP25去乙酰化修饰受SIRT1的调控；（4）HSP25能够与SIRT1蛋白发生相互作用，介导SIRT1对p53蛋白去乙酰化的调节；（5）HSP25蛋白127位赖氨酸为其乙酰化修饰位点；（6）HSP25 K127R突变体可促进阿霉素所致的H9c2心肌细胞凋亡。