一种抗原特异性基因修饰细胞治疗策略在前列腺癌治疗中的实验研究

Prostate cancer is an advanced malignant disease which is reliable to metastasis. The efficacy of curative implication as surgical resection and hormone-based therapy is limited. Cancer targeting biotherapy might be helpful to improve the effect of current therapeutics on it. Our previous study demonstrated that PSA-targeting single-chain antibody can specifically transfer Methotrexate (MTX) prodrug into PSA-positive prostate cancer cells and killed them effectively. Based on this founding, we designed and constructed a novel recombinant protein which comprises this PSA-specific single-chain antibody, a furin cleavage sequence and an active caspase-3, which can directly cleave PARP leading to programmed cell death. Our in vitro data showed the feasibility of our constructed molecule in specifically inducing apoptosis of PSA-positive prostate cancer cells. Here, to further decrease the dose of usage of this recombinant proapoptotic protein in the whole body and increase the local concentration of this molecule in tumor tissues, we propose to generate the genetic modified mesenchymal stem cells (MSCs) expressing our recombinant proapoptotic molecule and take the advantage of the tumor-oriented homing capacity of MSCs to increase the local concentration of this protein in in situ and metastatic cancer tissues. Given the safety of MSCs vesicle-based delivery system in cancer therapy, we will also explore the technology of gene silence or blocking antibody to pretreat the MSCs to inhibit their immunosuppressive effect in tumor niche. Collectively, we believe that the application of specific anticancer gene-engineered MSCs would hold great potential for prostate cancer therapies.

前列腺癌起病隐袭，易转移。手术治疗和激素疗法效果有限，肿瘤靶向疗法是现有治疗手段的重要补充。我们前期研究证明PSA靶向单链抗体能携带前体药物分解酶进入肿瘤细胞（Prostate,2006）。在此基础上，我们用直接凋亡诱导分子替换分解酶，构建了一种能够识别PSA抗原的重组杀伤分子，并在细胞学证实腺病毒表达的该重组分子对PSA阳性肿瘤的直接杀伤效果。为克服重组腺病毒的免疫原性、进一步降低重组分子全身使用的剂量、并提高肿瘤局部药物浓度，在本研究中，我们拟对低免疫原性的间充质干细胞（MSCs）进行病毒载体介导的基因修饰，利用其固有的肿瘤趋向性特点在癌灶局部快速富集并分泌表达该重组蛋白，进而发挥对原位及转移瘤的杀伤作用。同时，利用基因沉默和抗体封闭等技术对MSCs可能具有的肿瘤免疫抑制作用进行预处理，进而深入分析MSCs作为细胞载体的安全性。从而为前列腺癌的生物治疗建立一个高效、特异的细胞治疗平台。

本实验组着眼于前列腺癌靶向治疗策略的建立，在以往实验基础上我们此次成功构建了免疫源性低、渗透性强的PSA靶向重组免疫杀伤分子scFv-Fdt-tBid，该分子由三部分构成，分别为特异性针对PSA的单链抗体scFv基因、白喉外毒素膜转位功能肽Fdt编码序列、及凋亡诱导片段截短型Bid基因tBid序列。然而，如果单纯的将重组分子导入机体内会存在许多问题影响重组靶向分子的作用效果如重组分子需经过血液循环后才能聚集于肿瘤局部，作用距离长容易被机体免疫系统清除外还难以在肿瘤局部保证靶向杀伤分子的作用浓度，此外实体瘤内压力大导致重组分子难以进入肿瘤内部亦影响其作用效果。间充质干细胞（mesenchymal stem cell MSC）是一种绝佳的介导基因治疗的细胞载体。因此，我们利用MSC作为细胞载体，用重组基因scFv-Fdt-tBid对其进行修饰，建立双重靶向治疗模式。. 体外实验结果显示，scFv-Fdt-tBid能在MSC细胞中稳定表达并分泌，并能有效下调PSA阳性的LNCaP细胞、C4-2细胞、22RV1前列腺癌细胞的存活率。重组分子的表达对于MSC的增殖能力、分化能力等无明显影响。在共培养实验中，MSC. scFv-Fdt-tBid能有效地、特异地诱导PSA阳性前列腺癌细胞凋亡。在肿瘤趋向性检测中，体外Transwell实验显示前列腺癌细胞培养上清能有效地诱导MSC. scFv-Fdt-tBid的迁移。. 在体内试验中，小动物成像实验显示MSC. scFv-Fdt-tBid-LUC细胞通过尾静脉注射后能有效趋向于肿瘤部位并大量聚集，且免疫组化染色显示在肝、心、脾、肺肾组织内很少检测到重组分子表达，而在肿瘤部位重组分子高表达。体内抑瘤实验结果显示MSC. scFv-Fdt-tBid能明显抑制22RV1皮下肿瘤的生长，且肿瘤组织中检测到明显的凋亡发生，而通过对血液相关指标检测及内脏组织HE染色检测检测未发现明显的毒副作用。. 综上所述，本实验构建前列腺癌双重靶向杀伤模式能有效的诱导基因修饰的MSC在肿瘤部位聚集，并持续释放重组靶向杀伤分子对肿瘤实现有力的抑制作用。这种双靶向的治疗策略的提出是对前列腺癌传统治疗策略的一种有力的补充，并且对于临床靶向治疗的完善提供了理论及实验基础。