结核分枝杆菌北京基因型菌株的微进化与致病性的研究

Tuberculosis (TB) is still one of the leading causes of death in our country. The causative agent Mycobacterium tuberculosis (MTB) is an obligate human pathogen whose evolution is highly associated with human migration and development of human society. TB in China is mainly caused by Beijing family strains. Our previous genotyping data indicate a recently evolved sublineage R1 dominate in the population of Beijing family strains around China. The whole genome based dating suggest R1 sublineage originated and expanded at 5,000-6,000 years ago, during which the modern human in East Asia has transformed form Paleolithic Age to Neolithic Age. Due to the introduction of agriculture, the population size and density has greatly increased in the Neolithic Age. We hypothesize that R1 sublineage has acuminated specific mutations during its evolution, which allows R1 strains more successful in causing diseases and transmission in large human populations with high population density. The current study will firstly select representative R1 strains from pools of clinical isolates and sequence them; then, by whole genome comparison and further large scaled genotyping, we will identify R1 specific mutations (including point mutations, large or small indels); next, we will apply profound bioinformatics analysis to predict the potential functional effects of these mutations and multi-gene interactions, which may contribute to the dominant phenotype of R1 strains; at last, we will design functional experiment as well as cell and mouse infectious model to verify the molecular mechanism of pathogenesis of R1 sublineage. This study is of great significance to uncover the mechanism of human pathogen to adapt to changed host ecologies during the development of human society.

结核分枝杆菌具有潜伏感染的特点，潜伏期的长短反映了致病性的差异，而该特征的进化与宿主环境的演变密切相关。我国结核病主要由结核分枝杆菌北京基因型菌株所致。我们的研究表明R1亚型在北京基因型菌株中占绝对优势，并推算出该亚型起源和扩张年代在5-6千年前。该时期东亚人群已从旧石器过渡到新石器时代，人口数量大量增加。我们提出R1亚型菌株在进化过程中积累的特定遗传变异增强了其致病性使其成功地在高密度人群中传播和扩张的科学假设。本研究将选出代表性的R1亚型菌株进行全基因组测序，筛选出可能的遗传突变；经大样本临床菌株验证，鉴定出R1亚型特异的遗传变异；利用生物信息学方法分析遗传突变对基因功能的影响和多基因间的相互作用, 预测特定遗传变异导致R1亚型致病性增强的分子机制; 设计相关实验并利用细胞和小鼠感染模型验证提出的导致致病性增强的分子机制。本研究对揭示病原微生物微进化以适应宿主新环境的机制有重要意义。

全球结核分枝杆菌主要分为7个分支（I-VII型），不同分支具有不同的地理分布。我国结核病疫情主要由北京菌株（II型）所致。北京菌株在与东亚人的共进化过程中逐步分化成多个亚型。其中Bmy10亚型最晚分化产生，但在群体中所占比例却达到70%以上，因此被我们定义为“优势亚型”。我们和国际同行的研究表明，该亚型菌株具有传播能力强、感染后发病快、逃逸BCG免疫保护、引起免疫细胞促炎因子低表达等高致病性特征。结核菌优势亚型菌株的高致病性特征是与结核菌与人类长期共进化与自然选择的结果。揭示优势亚型菌株高致病性的进化机制，将丰富和完善微进化领域中多基因相互作用机制的理论体系，并为抗结核新药和疫苗的研发提供理论指导。在本项目的资助下，我们主要开展了以下三部分工作：1）我们通过与瑞士等8个国家的科学工作者合作，在全球收集代表性结核菌样本进行全基因组测序，基于贝叶斯模型推算结核菌最近共祖起源时间以及迁移路径，发现结核菌于7万年前起源于非洲，并伴随现代人类的走出非洲而传播至世界各地。2）在此基础上我们对大量的优势亚型代表性菌株进行系统分子地理分析，发现优势亚型菌株的起源时间为7000-8000年前，并在新石器时期的早期汉族人群中发生了显著的扩张，提示高致病性筛选的选择压力来源于当时人口密度的变化。3）我们通过对来自全球的超过1500株优势亚型和非优势亚型菌株进行比较基因组学分析，鉴定出优势亚型菌株在进化中积累的特有遗传变异；这些特有遗传变异包括44个SNP和2个短片段缺失，令我们惊讶的是，并未发现优势亚型菌株获得任何新的毒力基因或者大片段插入/缺失/重组，提示优势亚型菌株的高致病性特征是多个点突变积累的结果；通过生物信息学和基础实验对特有遗传变异进行研究发现，特有遗传变异显著富集在转录调控蛋白这一基因功能类别；两个启动子区域突变分别导致下游基因表达下调10-100倍，受影响一个热休克蛋白编码基因之前被证明与结核菌的毒力相关；此外，四个基因发生提前终止或移码突变，且这些基因全部定位在细胞壁，提示对细菌细胞壁的结构或宿主免疫识别发挥作用；18个非同义突变发生于氨基酸序列保守性位点，且这些蛋白主要参与信号转导等功能。以上结果表明，多个遗传变异均可能参与优势亚型致病性的改变，而非单个毒力基因获得或单基因突变所致，其高致病性进化机制最可能是多基因突变导致的基因调控网络改变或重塑的结果。