宿主蛋白CNOT1依赖Tat调控HIV-1转录和潜伏的机制研究

HIV-1 latency is the major obstacle for HIV-1 cure. The control of HIV-1 transcription is the key for HIV-1 latency. Deep understanding of HIV-1 latency is important for eradiation of HIV-1 reservoir. The applicant found that CNOT1 can bind LTR and interact with Tat. CNOT1 knockdown specifically inhibits Tat-activated HIV-1 transcription. CNOT1 is the subunit of CCR4-NOT complex, which can interact with Pol II and stimulate transcription. Thus, we speculated that CNOT1 is recruited by Tat to LTR for HIV-1 transcriptional control through regulating Pol II activity. However, the detail mechanism is unclear. On the basis of the current work, by upregulation/downregulation of CNOT1 level in the HIV-1 latency cell model, in combined with the high-throughput sequencing, we aim to clarify the role of CNOT1 in the activation of HIV-1 transcription and inhibition of HIV-1 latency. In combined CNOT1 mutagenesis with Co-IP, we will reveal the mechanism on the inhibition of HIV-1 latency by CNOT1. This study will help us to better understand the mechanism of HIV-1 latency and provide potential targets for anti-latency drug design.

HIV-1潜伏感染是艾滋病难以治愈的重要原因，认识其潜伏机制对寻找清除HIV-1的方法至关重要。HIV-1转录调控是影响其潜伏与否的关键，但我们对这个过程的理解有限。申请人前期发现CNOT1结合HIV-1长末端重复序列（LTR），并与HIV-1 Tat互作；敲低CNOT1特异性抑制Tat激活的病毒转录。已知CNOT1所在的CCR4-NOT复合体可与Pol II结合激活转录，据此推测，CNOT1被Tat招募到LTR，很可能通过与Pol II互作激活HIV-1转录。本项目旨在前期基础上，在HIV-1潜伏细胞模型中上/下调CNOT1，结合RNA-Seq分析，明确CNOT1激活HIV-1转录从而抑制HIV-1潜伏；通过突变体构建、蛋白质互作，解析CNOT1与Pol II的互作模式，进而揭示CNOT1抑制HIV-1潜伏的分子机理。研究将有助于加深理解HIV-1潜伏机制，为抗潜伏药物设计提供潜在靶标。

寻找艾滋病治愈途径是全球公共卫生领域迫切需要解决的关键问题，鉴定新型HIV-1转录调控因子并揭示其作用机制是探索艾滋病治愈途径的重要基础。申请人前期发现CNOT1结合HIV-1长末端重复序列（LTR），敲低CNOT1特异性抑制HIV-1Tat激活的病毒转录。因此，本项目旨在深入揭示CNOT1调控HIV-1转录和潜伏的机制。根据文献报道CNOT1与Pol II互作，且我们进一步验证CNOT1仅特异性调控Tat激活而非JQ-1和Prostrain激活的HIV-1转录。因此，我们集中在研究CNOT1是否可与调控Pol II活性的与Tat结合的宿主蛋白互作而激活HIV-1转录。首先，我们通过免疫共沉淀发现CNOT1及其所在复合体CCR4-NOT的多个亚基包括（CNOT2、CNOT6、CNOT7和CNOT10），均可与控制HIV-1转录关键的宿主复合体P-TEFb（包括CCNT1和CDK9两个亚基）互作。其次，通过染色体免疫共沉淀实验，我们发现瞬时转染Tat入细胞可显著增强CNOT1在LTR区域的结合，并且上调CNOT1表达可显著增强Pol II在LTR区域的结合。最后，我们发现下调或上调CNOT1表达可显著影响CCNT1蛋白水平而并非转录水平；反之，下调或上调CCNT1水平亦可显著影响CNOT1蛋白水平而并非转录水平，说明二者在结合后有相互稳定的功能。因此，与我们的假设一致，本项目证明CNOT1激活HIV-1转录的分子机制是通过与P-TEFb互作而被Tat招募至LTR区域，从而可促进Pol II在LTR区结合行使激活HIV-1转录的作用。国内外尚未见CNOT1在调控HIV-1转录中的作用和机制报道。因此，本项目研究结果将有助于我们加深理解HIV-1转录和潜伏的分子机制，创新性地证明宿主蛋白CNOT1很可能成为抗艾滋药物研发的新型靶标，为艾滋病治愈策略的研究提供新思路。