一种新型高效、低毒的脂质-聚阳离子基因载体的构建及作用机制的研究

Gene therapy as a new promising approach has brought new hopes for treatment of some difficult diseases. Efficacy and safety of gene carrier are the main problems of gene therapy. The synergistic effect between the cationic polymer and liposome (LP) in gene delivery has been proposed. Therefore, LP-PAE based on poly (L-aspartate-graft-PEI423) and liposome containing DOTAP was fabricated in this study. The formulation and preparation method of LP-PAE were optimized by evaluation of the character, transfection efficiency and cytotoxicity of LP-PAE. The mechanisms of cell internalization route, subcellular localization and endosome/lysosome rapid escape were also investigated. The in vivo transfection and toxicity of LP-PAE were studied by aerosol delivery to Balb/c mice. Furthermore, the therapeutic effect of pdcd4 using LP-PAE delivery in K-rasLA1 lung cancer model mice by aerosol delivery method was also discussed, thus, provide new ideas and experimental evidence for exploring a highly effective and non-toxic gene delivery system.

基因治疗作为一种新的治疗手段，为一些疑难病症的治疗带来了新的希望。基因治疗领域存在的主要问题是基因载体的有效性和安全性。本课题本着脂质体与阳离子高分子共同输送，协同增效的新思路，在高分子基因载体天冬氨酸接枝的聚乙烯亚胺（PAE）的基础上，联合使用脂质体,构建脂质天冬氨酸接枝的聚乙烯亚胺（LP-PAE）基因载体。通过评价LP-PAE的理化性质、转染效率及细胞毒性，进一步优化处方及制备工艺；探索基因载体LP-PAE的细胞摄取、细胞内分布及内涵体/溶酶体快速逃离等作用机制。并以雌性Balb/c小鼠为模型动物，评价Balb/c小鼠鼻腔喷雾给药(aerosol delivery)后，体内的基因转染效率和毒性。本实验最后还将以肿瘤抑制基因Pdcd4 为模型药物，K-rasLA1肺癌小鼠为模型动物，评价LP-PAE/Pdcd4 经鼻腔喷雾给药后的治疗效果。为构筑安全、有效的新型基因载体提供创新思路

本课题组制备了脂质-聚阳离子基因载体LP-PAE，完成了计划研究内容（1） 阳离子脂质体LP的制备及评价。采用乙醇稀释法制备阳离子脂质体LP，通过琼脂糖凝胶电泳实验，细胞毒性实验以及体外转染效率实验，筛选脂质体的最优处方。采用Zeta电位粒度测定仪测定脂质体LP/DNA的粒径及Zeta电位，透射电镜 (Transmission Electron Microscope，TEM)观察其形态。通过细胞内吞抑制剂对脂质/DNA复合物转染效率的影响，探讨细胞摄取机制。并以抑癌基因—程序性细胞死亡4基因 (programmed cell death 4，pdcd4)为模型药物，考察LP/pdcd4在SPC-A1细胞中的表达，评价其对治疗基因的传递效果。验证了所制备的阳离子脂质体具有较好的转染效率，为探索一种安全有效的基因传递系统，并进一步了解非病毒载体的特性提供了实验依据。（2）脂质聚阳离子基因载体LP-PAE的制备及评价。将脂质体最优处方LP 与不同质量比的天冬氨酸接枝的聚乙烯亚胺PAE与DNA复合物制成LP-PAE/DNA复合物，以细胞压缩能力、细胞存活率以及转染效率作为评价指标对PAE的最佳用量进行筛选。并对此复合物进行了粒径，Zeata 电位的测定及形态的观察，及细胞摄取机制及内涵体逃逸机制的探讨。以pdcd4为模型药物，考察LP-PAE/pdcd4在SPC-A1细胞中的表达，评价其对治疗基因的传递效果。证明了LP与PAE作为基因载体具有协同增效作用，有望成为临床上的基因治疗的载体，为进一步研究基因载体提供理论依据。（3）基因载体体内评价实验。采用荧光标记物Cy5SE标记DNA，制备LP-PAE/Cy5SE DNA。将其雾化递送至小鼠体内，通过活体成像仪观察药物在小鼠体内的分布。建立了肺癌细胞SPC-A1的裸鼠模型，以基因载体LP-PAE与治疗基因pdcd4形成复合物，通过尾静脉注射给药，监测移植瘤模型小鼠肿瘤增长情况，实验结果表明LP-PAE/pdcd4组肿瘤体积增长缓慢，表明LP-PAE可有效传递治疗基因pdcd4至肿瘤部位，从而可较好的抑制肿瘤生长。为肿瘤基因治疗的发展和应用提供了理论参考依据，对于基因药物传递体系的开发具有重要的科学意义。