冷胁迫下蓖麻种子吸胀早期蛋白质组学解析及抗冷相关基因的功能验证

Castor is one of the ten major oil crops, originates from tropical region but sensitive to chilling stress and vulnerable to chilling invasion. The preliminary study showed that early imbibition of castor seed germination (12 h) which was exposed to chilling stress (15 ℃) can significantly decrease seed germination and primary root growth rate. Protein is the final performer of physiological function, provides nutrition, and regulates internal biochemical reaction and metabolism process for seeds. Herein, early imbibed seeds from the castor inbred line YouBi 5 (a cold-resistance genotype) are obtained and used to identify the differential abundance protein species (DAPS) between chilling stress and control conditions. iTRAQ-based quantitative proteomic are used in this study. Western blot and qRT-PCR are carried out for detecting the expression pattern for DAPS. Rapid amplification of cDNA ends (RACE) is performed to amplify differentially expressed genes which show the same trends between transcript level and corresponding protein level. Arabidopsis plants are transformed using the floral dip method and homozygous transgenic lines are utilized for phenotypic investigation and cold resistance. The experiment will preliminarily function the DAPS involved in seed early imbibition stage, which can provide an important theoretical basis for castor molecular assisted breeding.

蓖麻是十大油料作物之一，起源于热带，对低温敏感且易受冷害侵袭。前期研究发现蓖麻种子萌发吸胀早期（12h）遭受低温（15℃）侵害能显著降低其萌发率与初生根的生长速率。蛋白质是生理功能的最终执行者，同时也是种子养料的提供者与其内部生化反应和代谢过程的调控者。本研究以蓖麻抗冷自交系油蓖5号为试材，采用iTRAQ定量蛋白质组学方法比较冷处理前后种子吸胀早期蛋白质丰度变化情况，鉴定差异丰度蛋白。通过Western blot与qRT-PCR技术分析差异蛋白的表达模式。利用RACE法克隆转录与蛋白丰度呈现相同趋势的差异蛋白基因，进而通过蘸花法转化拟南芥，分析转基因植株的表型及其抗冷性，初步验证冷胁迫下参与种子萌发吸胀早期的差异蛋白功能，为蓖麻的分子辅助育种提供重要的理论依据。

蓖麻是十大油料作物之一，起源于热带，对低温敏感。通辽地区蓖麻早春播种易受低温侵害，导致出苗不齐，进而降低其产量。因此挖掘蓖麻抗冷基因对选育蓖麻抗冷新种质具有现实意义。申请者首次发现蓖麻种子萌发吸胀早期（12 h）遭受低温（4 ℃）显著降低了种子萌发率与初生根的生长速率。该项目以优良蓖麻品系通蓖5号为材料，采用iTRAQ定量蛋白质组学方法比较冷处理前后种子吸胀早期蛋白质丰度变化情况，实验共鉴定到127个差异积累蛋白（DAPS），这些蛋白主要参与碳和能量代谢、翻译和翻译后修饰、逆境响应、信号转导等。酶联免疫吸附法 (ELISA) 结果表明该蛋白质组数据真实可靠。基于蛋白质组数据与生理指标测定，项目组提出了冷胁迫下蓖麻种子吸水早期的冷适应模型：（1）所有参与翻译过程DAPS的上调积累可能通过促进蛋白质合成从而提高种子的抗冷性；（2）逆境蛋白的上调积累可能保护细胞免受冷胁迫的损伤；（3）脂肪酸生物合成关键蛋白的上调积累可能通过增加不饱和脂肪酸的含量提高种子的抗冷性。该项目原始数据已上传于公共数据库ProteomeXchange（识别号：PXD010043）。为了提高候选基因的准确性，项目组结合了基因组、转录组、蛋白质组从不同层面克隆了一系列抗冷相关基因如RcSEC14p、RcTIPs、RcPIPs、RcHSFs、RcGPXs、RcKASI以及RcKASII等，并对其进行生信和表达模式分析。进一步对RcGPX4调控抗冷的机理进行了解析，通过构建过表达载体并转化拟南芥，实验发现RcGPX4在植物生长的不同阶段调控抗冷的机制不同。冷胁迫下RcGPX4正调控转基因株系的种子萌发，萌发率的升高与抑制ABA和提高GA与CTK信号转导途径基因的表达有关。RcGPX4在苗期负调控转基因株系的抗冷性，抗冷性的降低与H2O2含量的升高有关。H2O2既能使转基因中积累较高的MDA导致膜脂过氧化，又可作为信号分子打破原有GSH-ASA循环的稳态，同时通过影响MAPK3-ICE1-CBF-COR级联以及ABA依赖性途径关键基因的表达进而降低植株的抗冷性。该研究为蓖麻抗冷育种提供功能明确的基因资源。本项目发表SCI论文1篇，中文核心论文10篇，提交会议摘要3篇。