R-spondin1分子内Furin样序列调节肠隐窝干细胞自更新及其增殖的分子机制研究

As an important ligand binding with Frizzled/LRP6 Lgr5 and Lgr6 receptor, The R-spondin1 protein activates the canonical Wnt signaling pathway that is effective in promoting self-renewal and proliferation of intestinal crypt stem cells (the CBC cells). Allogeneic CBC cell transplant therapy can repair the damaged intestinal mucosa, But the CBC cell culture is inefficient and expensive. As the conserved active region of the R-spondin1 protein, Furin-like sequence regulates the CBC cell proliferation, but the mechanism is unclear. This subject contemplated to comparise the Wnt signal activation of Furin-like sequence functional fragment, Furin-like sequence deleting mutation of the R-spondin1 and the complete R-spondin1, and verify on the biological function of Furin-like sequence. Whatmore, biosynthesis peptide of Furin-like sequence regulates self-updating and proliferation capacity of CBC cell. And four branches modification peptides of Furin-like sequence are synthesised trying to replace R-spondin 1 on CBC cell culture system. Our study will provide experimental evidence for optimization of CBC cell culture conditions and new ideas for the treatment of diseases of the intestinal mucosal injury.

R-spondin1蛋白作为一种重要配体与Frizzled/LRP6、Lgr5和Lgr6受体结合并激活经典Wnt信号通路，它的激活能有效促进肠隐窝干细胞（CBC细胞）的自更新及增殖。异体CBC细胞移植治疗可以修复损伤的肠粘膜。但目前CBC细胞培养效率低下且耗费昂贵。Furin样序列作为R-spondin1的保守功能活性区域，其调节CBC细胞增殖的作用及机制不清。本课题拟通过比较Furin样序列的功能片段、Furin样序列删除突变的R-spondin1和完整的R-spondin1对Wnt信号的激活而验证Furin样序列的生物学功能；生物合成含Furin样序列的多肽与R-spondin1比较它们调节CBC细胞的自更新及增殖能力；并对其合成肽进行四分枝修饰，以期取代R-spondin 1优化CBC细胞培养体系。研究为CBC细胞扩增及培养条件的优化提供实验依据，为肠粘膜损伤性疾病的治疗提供新思路。

R-spondin1蛋白作为一种重要配体与Frizzled/LRP6、Lgr5和Lgr6受体结合并激活经典Wnt信号通路，可启动干细胞更新、组织的修复以及肿瘤的发生发展，其具有成为生物治疗靶分子的应用前景。但目前CBC细胞培养效率低下且培养体系中需要消耗大量的R-spondin1和Wnt 3a等因子，昂贵的上述因子阻碍其临床应用。Furin样序列作为R-spondin1的保守功能活性区域，其调节CBC细胞增殖的作用及机制不清。将Furin片段进行相应的分枝肽设计合成，取代R-spondin 1应用于肠隐窝干细胞培养体系中，以期提高肠隐窝干细胞的培养效率及其降低成本，并探讨Furin样序列及其修饰肽刺激结肠癌类干细胞后对细胞表型的影响及其分子机制研究。.本课题对R-spondin 1分子内Furin样序列调节肠隐窝干细胞增殖分子机制进行研究，并探讨其对肠隐窝干细胞培养体系的影响。主要研究内容如下：CD133/CD44流式联合分选培养结肠癌类干细胞株，探讨R-spondin 1蛋白及其Furin结构域激活Wnt/β-catenin 信号通路的生物学效应；应用Furin样序列修饰肽作用于肠隐窝干细胞培养体系，分析Wnt信号相关蛋白活性，检测肠隐窝干细胞标志物 Lgr5、CD133、Ascl2；探讨Furin样序列及其修饰肽刺激结肠癌干细胞后细胞EMT可塑性关系；探讨干性转录因子ASCL2对结肠癌类干细胞表型可塑性影响及其分子机制研究。.研究发现：1，Furin-1刺激wnt信号效果与R-spondin 1接近；2，Wnt3A因子与Furin-1共刺激细胞表达WNT信号并呈剂量依赖性增强；3，修饰肽Furin-1-BP4比Furin-1激活wnt信号效果增强，且可替代R-spondin 1激活wnt信号；4，成功分选CD133+/CD44+结肠癌类干细胞，受Furin-1-BP4刺激后，其干性基因表达增高；5，干性转录因子ASCL2可影响结肠癌类干细胞表型，ASCL2与CDX2、MUC2、TFF3表达存在负相关性；6，干性转录因子ASCL2通过靶向结合到肠上皮分化因子CDX2启动子-284/-279区顺式作用元件而抑制其转录表达，从而抑制结肠癌细胞向杯状细胞表型分化。旨在为CBC细胞培养优化提供实验依据，为肠道粘膜更新异常引起的组织损伤、炎症性疾病及肿瘤的防治提供新的思路。