甲异靛抑制白细胞趋化性迁移的新颖生物学功能研究及其药物靶标鉴定

Small molecular compound meisoindigo is the derivative of traditional Chinese medicine indirubin and was applied in the treatment of chronic myeloid leukemia. The biological activity and mechanism of meisoindigo is still unclear recently, thus discovering the novel biological activity of meisoindigo and identifying its direct target is very significant. Leukocyte chemotactic migration refers to the process of directed movement of leukocytes under the stimulation of chemokines with concentration gradient, and zebrafish is an ideal in vivo model organism to study this biological process. It was reported that inhibiting leukocyte chemotactic migration can efficiently ameliorate inflammatory diseases. In this study, zebrafish model based drug screen was performed and we firstly identified that the novel biological activity of meisoindigo in inhibiting leukocyte chemotactic migration. Furthermore, this study will evaluate the inhibitory effect of meisoindigo on the chemotactic migration of the human leukocytes. In addition, using the method of protein affinity purification, the chemical probe of meisoindigo conjuncted with biotin would be applied to “fish” the binding protein, followed by mass spectrum analysis, in vitro binding assay and functional assay, confirming that the binding protein is the drug target of meisoindigo. At last, in the human leukocytes and zebrafish model, we will dissect the regulatory role and molecular mechanism of meisoindigo’s target protein in the leukocyte chemotactic migration, thus providing the basis for the novel application of meisoindigo in the treatment of inflammatory diseases.

小分子化合物甲异靛是中药靛玉红的衍生物，被用于慢性粒细胞白血病的临床治疗，当前甲异靛功能及机制仍不十分清楚，因此，发现甲异靛新的生物学功能及鉴定其药物靶标意义重大。白细胞趋化性迁移是指白细胞沿趋化因子浓度梯度作定向移动的过程，斑马鱼是体内水平研究白细胞趋化性迁移的理想模式生物。此前研究表明，抑制白细胞趋化性迁移能有效治疗炎症性疾病。本项目即利用斑马鱼模型进行小分子化合物筛选，并首次发现甲异靛具有抑制斑马鱼白细胞趋化性迁移的能力。本项目将进一步验证甲异靛对人类白细胞趋化性迁移的影响，并通过蛋白亲和纯化方法，利用生物素标记的甲异靛化学探针“钓取”其直接结合蛋白，利用蛋白质谱分析、体外相互作用及蛋白功能检测等方法，证实该结合蛋白为甲异靛的药物靶标；最后，在人类白细胞及斑马鱼模型中，验证甲异靛靶标蛋白在白细胞趋化性迁移过程中的调控作用及分子机制，从而为甲异靛用于炎症性疾病的治疗奠定基础。

小分子化合物甲异靛是中药靛玉红的衍生物，被用于慢性粒细胞白血病的临床治疗，当前甲异靛功能及机制仍不十分清楚，因此，发现甲异靛新的生物学功能及鉴定其药物靶标意义重大。白细胞趋化性迁移是指白细胞沿趋化因子浓度梯度作定向移动的过程，斑马鱼是体内水平研究白细胞趋化性迁移的理想模式生物。此前研究表明，抑制白细胞趋化性迁移能有效治疗炎症性疾病。我们利用斑马鱼模型进行小分子化合物筛选，首次发现甲异靛具有抑制斑马鱼白细胞趋化性迁移的能力，然而，其抗炎活性及机制并不清楚。遂利用LPS诱导的急性炎症小鼠模型，发现甲异靛能有效降低LPS诱导的小鼠模型的死亡率，并明显缓解靶器官肺及结肠组织的炎性损伤及炎症细胞的浸润程度；进一步研究发现，单核巨噬细胞亚群向靶器官（如肺及结肠）迁移明显受到抑制，从而进一步验证了甲异靛通过抑制单核巨噬细胞迁移而发挥抗炎作用的生物活性，与斑马鱼模型中抑制炎性细胞迁移的结果一致。随后，我们利用趋化因子芯片的方法发现，甲异靛能有效降低MCP-1及MCP-5等多种与单核/巨噬细胞密切相关的多种趋化因子的血清浓度；此外，利用甲异靛处理小鼠单核巨噬细胞系，通过Realtime PCR的方法证实了甲异靛抑制MCP-1及MCP-5的分泌，从而进一步阐述了甲异靛发挥生物活性的作用机制。为了鉴定甲异靛直接靶标，我们通过蛋白亲和纯化方法，利用生物素标记的甲异靛化学探针“钓取”甲异靛直接结合蛋白，并通过蛋白质谱分析、体外相互作用等方法，证实生物素标记的甲异靛化学探针保留了甲异靛的部分生物活性，用该探针“钓取”的蛋白混合物中，过氧化物酶1，2 (peroxiredoxin 1,2, PRDX1,2) 的丰度最高，进一步证实PRDX1,2与甲异靛进行直接结合，是甲异靛的潜在药物靶标. 在本课题中，我们系统性的解析了甲异靛的功能、靶标及分子机制，为甲异靛用于炎症性疾病的治疗奠定理论基础。基本完成了主要研究内容，并基本实现了预期研究目标。