铁转录因子对阴沟肠杆菌定植海洋和高致病性的作用研究

Enterobacter cloacae is a kind of terrigenous pathogen which producing extended-spectrum β-Lactamase and AmpC β-Lactamase, brings enormous challenges to the clinical treatment. As a freshwater bacterium, it is found in drain outlet and surrounding waters from multiple locales, that is a big threat for aquaculture and tourist industry of coastal regions. Previous experiment revealed that iron might be one of the main factors which helped E. cloacae colonized in marine environment. Ferric uptake regulator is an important protein not only regulates iron metabolism regulation, but also involved in diverse cellular processes such as environment resistance and celluar reproducing. But the molecular mechanism of Fur regulation of E. cloacae colonization of the marine environment is not clear. This study intends to explore the relationships between the ferric uptake regulator protein Fur and colonisation related genes which regulated by Fur. By building fur mutant strain and 2D-DIGE, the differential expression genes of whole proteomics are examed in drain outlet enviroment.The relationships are between iron and pathogenicity under Fur regulation are ascertained. Bioinformatics analysis and real-time PCR are used to confirm the Fur regulated genes. The results will reveal the colonisation and virulence related genes regulated by Fur directly and comfirm the functions of Fur involved in environment colonization and pathogenicity.

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是一种具有超级耐药性的陆源致病菌，给临床治疗带来了巨大的挑战。作为陆生菌，其却在排污口及周边海域中被发现大量存在，这对沿海养殖业和旅游业是一个巨大的威胁。前期实验表明，铁代谢在其定植海洋过程中发挥了重要作用。铁转录因子Fur是细菌重要的铁代谢调控因子。目前对Fur是通过怎样的机制来调控阴沟肠杆菌定植海洋环境的，尚不清楚。本研究拟开展铁调节因子Fur调控定植相关基因的研究，通过构建fur缺失突变株，利用2D-DIGE技术，比较野生型菌株与fur突变株在排污口条件下蛋白水平的差异，筛选出Fur调控的海洋定植及毒力基因，并进行验证；确定Fur调控下铁浓度与致病性的关系；通过生物信息学分析，构建Fur调控的海洋定植及致病性代谢网络及调控模式，为进一步明确Fur功能及其调控机制提供奠定基础。

本研究通过从陆源排污口分离获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)为研究对象，利用双向荧光差异凝胶电泳配合质谱技术分析了不同培养条件下阴沟肠杆菌相关功能蛋白的差异表达。共获得多个表达存在显著性差异的蛋白，其按基因按功分为四大类，分别为物质运输（49.4%）、信息识别（16.3%）、细胞结构组成（18.6%）及生物学调节（15.7%）。在差异蛋白中有 23.5%的蛋白参与铁代谢循环。利用Red 重组技术构建了阴沟肠杆菌Δfur 突变株，比较了野生株在铁缺乏与铁富余条件下、以及铁富余条件下野生株与Δfur 突变株的差异蛋白，其中三价铁ABC转运蛋白、铁调节外膜毒力蛋白、细胞间质铁结合蛋白、吡哆胺5’-磷酸氧化酶相关血红素铁利用蛋白、铁调节蛋白A、铁转运蛋白A、三价铁复合物受体、铁蛋白脱羧酶、铁载体受体、铁视紫红质外膜蛋白受体、有载铁体受体、铁色素ABC转运蛋白等与铁代谢密切相关的蛋白在野生株中表达量有变化。这些基因隶属于Fe2+运载体Feo系统、ABC型铁运载体、基于铁载体的铁获得系统、基于血红素等的铁获得系统、为铁获得提供能量的Ton B-Exb B-Exb D复合体、铁贮存系统。此外，差异蛋白还包括与致病性相关的蛋白如鞭毛蛋白A、大肠杆菌素受体、志贺样毒素等。与阴沟肠杆菌环境适应及定植相关的蛋白如周质氨基酸结合蛋白、外膜通道蛋白、饥饿/固定相保护蛋白质、氧化还原酶等蛋白表达量也上调。对以上差异蛋白进行转录水平的差异验证，发现在突变株和野生株中，各蛋白在转录水平的差异表达量与蛋白差异表达量大部分均相符。通过荧光定量PCR技术检测了fur等基因在不同铁离子浓度下表达量的差异，并以阴沟肠杆菌典型的毒力相关基因irp2、fhuA、sltA等作为检测对象，证明了在野生株中随着铁离子浓度增大，毒力基因的表达量均明显增加。