轮状病毒VP8与VP5抗原区相互作用及解离机制的研究

Trypsin primes rotavirus for efficient infectivity by cleaving the spike protein VP4 into VP8* and VP5*. After binding to the sialic acid receptor, the VP8* heads must dissociate from the tip of VP5 to expose the hydrophobic membrane fusion region, which will mediate the penetration of rotavirus. However, the binding and dissociation mechanism between VP8 and VP5 was still not known. In our previous studies, by analyzing the cryo-EM structure of rotavirus, the applicant found that there was interaction between VP8 and VP5. In addition, both trypsin digested VP8 and N-terminal truncated VP8 can bind to VP5 antigen as analyzed by a direct binding assay. In this project, the key amino acids participated in VP8 and VP5 interaction analyzed by structural analysis will be verified by N-terminal deletion and site-directed mutation. In addition, the impact of receptor binding and physicochemical factors on VP8 and VP5 interaction will also be studied. Thus, elucidating the mechanism among VP5-VP8 interaction and the possible dissociation mechanism of VP8 and VP5 during rotavirus infection.

胰酶酶切将轮状病毒VP4蛋白酶切成VP8和VP5可活化轮状病毒。在轮状病毒的感染过程中，VP8与唾液酸受体结合后，与VP5抗原区分离，暴露出原被VP8头部区域掩盖的膜融合区，进而介导轮状病毒入胞。在这一过程中，VP8与VP5抗原区相互作用机制以及解离机制目前尚不清楚。申请人在前期研究中，通过对轮状病毒冰冻电镜结构分析发现VP8和VP5抗原区存在相互作用；同时，酶切获得的VP8蛋白和截短表达的VP8蛋白与VP5蛋白之间均存在相互作用，并在此基础上建立了分析二者相互作用的方法。在前期工作的基础上，本课题拟通过结构分析发现VP8和VP5抗原区相互作用可能关键氨基酸，并通过缺失突变和定点突变进行验证；同时，分析受体结合和理化因素对VP8和VP5抗原区相互作用的影响。通过以上研究以期阐明轮状病毒感染过程中VP8和VP5抗原区相互作用及解离的可能机制。

轮状病毒是导致5岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体，其感染是一个多受体介导的、多步骤的复杂过程。刺突蛋白VP4可以介导轮状病毒的吸附和入胞过程，在轮状病毒的感染中发挥着重要的作用。VP4蛋白对胰蛋白酶敏感，可以被酶切形成VP8*和VP5*，从而增强轮状病毒的感染性。胰酶酶切后，VP8仍结合在VP5*的顶部，在轮状病毒感染过程中，VP8*蛋白要从VP5*顶部解离才能暴露出VP5*顶部的疏水区，从而介导轮状病毒的入胞。目前，轮状病毒VP4蛋白的结构已经成功解析，但是，VP8和VP5相互作用的机制及其在轮状病毒感染过程中的解离机制仍不清楚。.本项目在课题组前期工作的基础上，通过体外实验对轮状病毒VP8*和VP5*相互作用及解离的机制进行了初步研究。首先，我们基于目前已经解析的轮状病毒冰冻电镜结构（3IYU），通过Discovery Studio软件分析VP8*和VP5*交界面氨基酸，发现可能的关键位点。在此基础上，我们进一步通过截短蛋白和氨基酸定点突变分析参与VP8*和VP5*相互作用的关键区域和关键氨基酸。结果发现，aa37-48是维持VP8*和VP5*相互作用的关键区域，而P37、T43、Y45和Y69和VP8*蛋白与VP5*相互作用的关键氨基酸，主要相互作用力包括氢键和疏水相互作用。在解离机制方面，我们发现，对于所选毒株，受体结合有助于VP8*和VP5*的解离，而pH降低对于部分毒株则不是必需的。同时，对于LLR和DS-1，受体结合和pH降低对于VP8*和VP5*的解离具有协同作用。.本项目初步阐明了轮状病毒VP8*和VP5*蛋白相互作用的机制及其在轮状病毒感染过程中的解离机制，在后续研究中，可进一步通过反向遗传学、冰冻电镜结构解析等进一步验证。本项目的开展有助于阐明轮状病毒的感染机制，并为轮状病毒疫苗和药物的研究提供了依据。