转基因乳酸菌表面展示猪轮状病毒保护性抗原及其诱导黏膜免疫的研究

The project is designed to build of transgenic Lactobacillus expressing the protective antigens of the porcine rotavirus based on its pathogenic and immune characteristics, and using the genetically modified lactic acid bacteria to stimulate the mucosal immune system and induce the specific mucosal immune response of the animals. The two plasmids which consist of the temperature-sensitive helper plasmid and main plasmid are used as a gene targeting system, targeting knockout of lactic acid bacteria of non-essential upp and xgprt of gene. The mucosal adjuvant LTB and protective antigen of porcine rotavirus VP4 and VP7 gene are inserted in the upp and the xgprt sites Respectively.Expression of the protective antigens of the porcine rotavirus was detected via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting, and immuno-fluorescence, and both local mucosal and systemic immune responses against rotavirus were detected in BALB/c mice and Piglets immunized orally with the transgenic Lactobacillus expressing VP4-VP7 Fusion protein. This is new way for the prevention of rotavirus-induced diarrhea in pigs, and the targeting system provide an important technology platform for the expression of other heterologous functional proteins or other protective antigen.

猪轮状病毒所致猪腹泻在我国危害严重。本课题综合分析其致病与免疫特点及乳酸菌多种肠道益生功能，设计稳定表达猪轮状病毒保护性抗原，并能持久刺激黏膜免疫系统的转基因乳酸菌：利用构建的温度敏感型辅助质粒及主质粒构成的双质粒整合型基因打靶系统，定向敲除乳酸菌非必需upp和xgprt基因，在upp插入黏膜佐剂LTB；在xgprt位点插入猪轮状病毒保护性抗原VP4和VP7基因片段，通过温度敏感及氟尿嘧啶筛选，获得具有免疫增强作用的表面锚定表达猪轮状病毒保护性抗原转基因乳酸杆菌。该菌不携带任何选择标记，达到真正意义的食品安全级活菌载体。以此活菌口服免疫动物，测定肠道特异sIgA、血清抗体、抗体中和活性和对猪免疫保护作用，为轮状病毒引起的猪腹泻免疫预防探索新途径；建立的乳酸菌无痕打靶系统，对表达其它异源功能蛋白或其他保护性抗原奠定重要的技术平台。

猪轮状病毒所致猪病毒性腹泻在我国流行广，发病率高，危害严重。本病是典型的黏膜感染性疾病，综合分析该病致病与免疫特点及乳酸菌多种肠道益生功能，本课题设计了能够稳定表达猪轮状病毒保护性抗原，并能持久刺激黏膜免疫系统的转基因乳酸菌，为实现乳酸菌基因组的基因插入和缺失，首先构建了乳酸菌基因打靶系统，该系统为温度敏感型辅助质粒及主质粒构成的双质粒整合型基因打靶系统，主质粒具有打靶功能，不具有复制功能，辅助质粒具有复制功能，不具有打靶功能，二者同时转入乳杆菌内，既可以进行基因打靶，又可以进行质粒的复制作用，在操作中，利用不同温度进行筛选，即37℃打靶复制，42℃复制停止并菌体脱质粒，经过几轮筛选就可以获得不带任何残留质粒，并实现在乳酸菌位点的基因插入或缺失，完成在乳酸菌基因组进行基因打靶功能，该系统已获国家发明专利授权。为验证该系统是否可插入外源基因到乳酸菌基因组，本实验以产气荚膜梭菌去毒的α毒素基因为靶基因，构建基因表达盒，利用基因打靶系统将其插入到乳酸菌基因组，并实现了外源基因的表达，口服免疫小鼠，可产生特异性细胞免疫、体液免疫、局部黏膜免疫以及免疫保护作用；进一步证明了通过基因组插入外源基因可获得外源基因的有效表达；为了实现外源基因的高效表达，本实验利用乳酸菌基因upp基因为反选择标记，以组成型高表达位点的干酪乳杆菌丙酮酸水合酶基因为插入位点，构建了基因组表达猪轮状病毒VP4蛋白的转基因乳酸菌结果显示，与△upp L.casei相比较，L.casei-EVP4具有相同的菌体形态和生长特性，且对氯霉素敏感，表明重组菌失去了重组质粒的残留。通过重组干酪乳杆菌VP4蛋白表达检测表明，在不同碳源的培养基中L.casei-EVP4均可稳定表达VP4蛋白；菌落PCR和序列测定50次传代后的L.casei-EVP4，插入的外源基因未发生基因缺失和序列改变，表明其具有遗传稳定性。为评价L.casei-EVP4免疫效果，以小鼠为动物模型，口服免疫L.casei-EVP4后不同时间检测了免疫小鼠的粪便、阴道、呼吸道黏膜抗体、血清抗体以及免疫小鼠脾细胞增殖特性和相关细胞因子，检测结果表明，小鼠免疫后，不但有效刺激机体的局部免疫，系统体液免疫，还能够刺激机体的细胞免疫应答。