Angiopep-2介导的共载siDNA-DBT/卡莫司汀的双靶向纳米复合物增强脑胶质瘤放化疗作用效果及其机制研究

Low sensitivity and poor specificity were recognized as two major problems in clinical radiochemotherapy of glioma, which always resulting in the patients's management failure and coursing the treatment abandonment. The preliminary experiment verified: Dbait (siDNA-DBT), a new generation of biological radiation sensitizer, could effectively enhance the radiosensitivity of malignant glioma U251/R cells. Therefore, a co-delivery of siDNA-DBT & chemotherapy drug nano-carrier, applying sequential blood-brain barrier(BBB) penetration and glioma targeting, may be expected to improve the effect of concomitant radiochemotherapy and solve the two major clinical problem in glioma treatment. Based on our early research in brain and tumor targeting drug delivery, this subject intends to build a new targeted nano-complex A-PAMAM(DBT/BCNU) mediated with BBB and glioma cells dual specific peptide Angiopep-2, which could co-deliver siDNA-DBT and anti-glioma drug carmustine (BCNU) with cationic polymer PAMAM. The targeted activity, transfection and gene silencing efficiency, the anti-tumor activity, drug distribution, safty, synergistic anti-tumor activity and mechanism of A-PAMAM(DBT/BCNU) in vitro and vivo would be studied. Research would provide a new way for combined treatment of glioma and other solid tumors.

放化疗敏感性低、特异性差是脑胶质瘤临床治疗中的两大难题，常导致病人无法耐受甚至放弃治疗。本课题前期验证：新一代生物放射增敏剂Dbait（siDNA-DBT）可有效增强恶性脑胶质瘤U251/R细胞的放射敏感性。因此，构建能突破血脑屏障BBB并靶向胶质瘤细胞的纳米基因载体，将siDNA-DBT和化疗药同步靶向递送、作用至肿瘤组织，有望减小照射和化疗药的毒性，提高脑胶质瘤的治疗效果。本课题在前期肿瘤靶向及脑靶向给药基础上，拟将siDNA-DBT与化疗药卡莫司汀（BCNU）以阳离子聚合物PAMAM共载，并以对BBB和胶质瘤细胞双重靶向的多肽Angiopep-2特异性修饰，构建新型靶向纳米复合物A-PAMAM(DBT/BCNU)，并对其脑部及肿瘤靶向性、细胞转染和基因沉默效率、体内分布、抗肿瘤活性、安全性、放射增敏机制和放化疗同步抗肿瘤机制进行研究，将为脑胶质瘤及其它肿瘤的综合治疗提供新途径。

胶质瘤是原发性颅内肿瘤中最常见的类型，目前，手术切除辅助化疗联合放疗是治疗脑胶质瘤的标准方式，但是，胶质瘤对放疗不敏感，BBB和BBTB的存在又导致颅内抗肿瘤药物浓度较低，并且胶质瘤浸润性生长的特性导致术后易复发，治疗效果不佳。同步放化疗是脑胶质瘤治疗的研究热点，而放射增敏剂是逆转肿瘤辐照抗性的重要手段，本课题应用广谱抗癌药阿霉素和放射增敏剂Dbait，通过Angiopep-2靶向修饰的胆固醇多肽胶束递送至肿瘤细胞内，并研究其联合辐照治疗对脑胶质瘤的体内外抑制作用。首先采用固相合成法将胆固醇、赖氨酸、精氨酸、基质金属蛋白酶-2底物肽及Angiopep-2合成两亲性嵌段共聚物，通过自组装形成多肽胶束，再经DTSSP交联形成交联胶束ch-Kn(s-s)R8-An（n=3，5，7）。研究发现，当N/P=10时，ch-K5(s-s)R8-An/pEGFP胶束具有最佳载基因能力及细胞转染效率，而且其对BCECs细胞和U251细胞的细胞毒性均较低，可特异性靶向BCECs细胞和U251细胞，对体外BBB具有较高的跨膜效率。然后我们制备了共载DOX和Dbait的多肽胶束ch-K5(s-s)R8-An/(Dbait-DOX)， ch-K5(s-s)R8-An/DOX可以快速响应肿瘤细胞内环境模拟条件，在pH5.5和富含还原性物质DTT条件下DOX的累积释放率迅速上升。共聚焦实验表明多肽胶束可以有效的将DOX和Dbait同时递送至肿瘤细胞的细胞质及细胞核内。ch-K5(s-s)R8-An/(Dbait-DOX)联合低剂量辐照处理的细胞存活率和克隆形成率均显著低于其他组（P<0.05），细胞凋亡率（42.70%）远高于其他组（P<0.01）。另外，Western blot实验证实了多肽胶束可以有效的将Dbait递送至U251细胞中，导致细胞内的γ-H2AX增加，抑制DNA损伤部位及时修复。体内实验结果表明， ch-K5(s-s)R8-An/(Dbait-DOX)可以通过Angiopep-2的修饰有效跨越血脑屏障并蓄积在脑胶质瘤组织内，可有效将Dbait递送至裸鼠的脑胶质瘤组织内，共载DOX和Dbait并联合低剂量辐照对体内脑胶质瘤的生长具有协同抑制作用。.本课题研究了共载化疗药物DOX和放射增敏剂Dbait的胶束联合放疗对脑胶质瘤的作用，为脑胶质瘤和其它肿瘤的临床治疗提供了新思路。