KDO8PS同源寡聚体形成机制及其在竹笋芽萌发中的作用

Bamboo bud germination is an important development stage to form bamboo quality and material,which the accumulation of polysaccharide pectin class on cell wall is one of the main material in the fast growing shoots.3-Deoxy-D-manno-octulosonate-8-phosphate synthase(KDO8PS) is responsible for the bio-synthesis of eight carbon sugar KDO in pectin and thus regulates the growth and development of different tissues and organs.We first discovered in our previous research work that KDO8PS is a homo-oligomeric enzyme with two different protein conformation. KDO8PS from plant is demric and can be converted it to a tetramer in high concentration of enzyme solution. Combined with features of KDO8PS differential space-time gene expression, we inference that KDO8PS could change of the enzyme structure stability or maintain enzyme activity through oligomers conformation transformation and affect the cell wall polysaccharide biosynthesis process of bamboo shoots .For identifying the cause of KDO8PS enzyme oligomers to further understand its regulating role for bamboo shoot germination, in this study we will complete determination of KDO8PS enzyme structure with molecular biology and structural biology methods based on the heterologous expression and purification of bamboo KDO8PS. we also explore target enzyme functions and roles by using gene knockout technology, transgenic technology and RNA-seq analysis so that we can lay the foundation for revealing the molecular mechanism of bamboo shoot development and material formation in the future.The crystal structure of AtKDO8PS has been obtained.

笋芽萌发是竹笋品质及材质形成的重要发育阶段，这一过程细胞壁果胶类多糖累积是笋快速高生长的主要物质基础之一。脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶（KDO8PS）负责果胶中八碳糖KDO的生物合成，可调控不同组织器官的生长发育。申请者在前期研究工作中首次发现，酶寡聚体中同源二聚体和四聚体的相互转化同酶浓度变化正相关，结合该基因时空差异表达特征，推断在笋芽萌发过程中，寡聚体构象转变可通过酶结构稳定性的改变维持酶活性的不同状态，从而调控笋芽细胞壁多糖合成代谢。为探明KDO8PS同源寡聚体成因，理解其对于笋芽萌发的调控作用，本研究拟采用分子生物学及结构生物学等实验手段，在毛竹KDO8PS表达及分离纯化基础上，完成寡聚体结构解析；利用基因敲除技术、转基因过量表达及RNA-seq等技术，探讨该酶在笋芽萌发中的功能和作用，从而为今后揭示笋芽发育及材质形成的分子机制打下基础。本项目已获得拟南芥KDO8PS晶体结构。

毛竹（Phyllostachys edulis）属于禾本科（Gramineae）竹亚科（Bambusoideae）刚竹属（Phyllostachys）是我国分布最广的传统经营竹种，人工栽培面积最大，也是竹类植物中用途最为广泛的竹种，集材用、食用、观赏等为一体，经济利用价值最高的竹种。已有研究表明竹笋芽萌发同细胞壁果胶多糖物质代谢有密切关系。脱氧辛糖酸 -8- 磷 酸 合 酶 （ 3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS）[EC: 2.5.1.55]是生物合成细胞壁果胶中KDO分子的一种关键酶，但该酶的结构和功能尚待确定。本研究首选通过基因克隆手段获得酶基因，通过构建原核表达载体，在大肠杆菌中成功获得该酶的高效表达；采用亲和层析和分子筛技术获得了该酶的纯化蛋白，并首次获得了该酶蛋白的晶体及同源模建结构；根据其分子结构特点，进一步设计该酶的突变体，在不同酶溶液浓度、不同外界环境因子诸如温度、pH 等的变化条件下，测定相应酶特性指标，观察该酶寡聚体构象变化的规律。利用转录组和qPCR测定分析了KDO8Ps基因的表达谱特征。研究结果表明：植物来源的KDO8Ps其三维结构为不对称同源四聚体，这与微生物大肠杆菌的KDO8Ps的不对称同源四聚体结构相似，通过对不同来源KDO8Ps酶热稳定性分析，发现不同来源KDO8Ps的热稳定性有较大差异，植物来源的较微生物来源的KDO8Ps热稳定性高，其中毛竹KDO8Ps热稳定性最高；毛竹KDO8Ps属于同源寡聚体结构，不同条件下可以二聚体、四聚体形式混合形式出现，其中c末端-尾巴为其特有结构，其结构对于维持寡聚体结构稳定性有着重要作用。该基因的属于组成型表达，在不同组织中表达量相对稳定。通过转录组测序结果结合全基因组数据分析，还发现若干重要基因家族，如LBD,YABBY,ZFHD,HSF,DJ,JRL等也参与了笋芽的快速生长。上述研究结果对于阐明毛竹笋芽萌发机制及毛竹果胶多糖的生物合成途径奠定了重要基础，同时对于今后碳汇竹林、生态林材质改造以及速生植物新品种的培育具有重要意义。