基于二代测序的小细胞肺癌放化疗抵抗机制研究

Our ongoing clinic trial has accumulated 276 limited stage small-cell lung cancer (SCLC) patients treated with concurrent chemoradiation and 31% of them developed local recurrence because of chemoradiation resistance. We have completed genome sequencing in 3 pairs of specimens (SCLC primary lesion tissue paired with recurrent tissue). The results showed that loci of recurrence occurred, including MESP2 and KDM6B genes mutations, PIK3R1 and RAD50 gene amplification. Accordingly, we propose study hypothesis that mutations in key genes of cancer signaling pathways cause chemoradiation resistance in recurrent SCLC. Further, we intend to explore the genomic spectra from paired tumor DNA and serum DNA in chemoradiation resistant patients to screen the key mutation genes. The results will be validated in expanded clinical samples detected by Sanger sequencing and digital PCR, gene transfection and silencing, in vivo tumor formation assay were used in gene functional studies. This study will elucidate the role of key mutational genes in chemoradiation resistance and construct the signaling pathway networks to reveal the molecular mechanism for potential targets to overcome chemoradiation resistance.

在我们局限期小细胞肺癌（SCLC）同步放化疗临床试验276入组患者中，31%出现靶区内复发，复发灶具放化疗抵抗性，其分子机制不明。我们已完成3对配对标本(治疗前与复发后的同一部位SCLC组织)的基因组测序，初步筛选出与SCLC放化疗抵抗相关的潜在基因变异（MESP2和KDM6B突变；PIK3R1和RAD50扩增）。据此提出研究假说：原发的或治疗中获得的关键基因变异及其信号网络赋予SCLC放化疗抵抗性。围绕这一假说，拟进一步从配对肿瘤组织和ctDNA着手，采用二代测序，获取SCLC放化疗抵抗的基因谱，验证抵抗关键基因变异。扩大组织和血液样本，采用Sanger测序、数字PCR、基因转染与沉默、裸鼠移植瘤，进行体内外功能验证，从组织、细胞、动物水平解析关键基因变异在放化疗抵抗中的作用，构建其分子调控网络。本项目的实施，将揭示SCLC放化疗抵抗的分子机制，为逆转放化疗抵抗提供靶标。

局限期小细胞肺癌（SCLC）易产生放化疗抵抗，其分子机制不明。为了阐明SCLC放化疗抵抗的机制，本项目开展了以下研究：.（1）采用全外显子测序（WES）及细胞功能实验阐明了SCLC放化疗抵抗的关键基因变异：我们完成了11对SCLC配对肿瘤组织标本的WES，找到相关基因及信号通路（PI3K-AKT）异常在局限期SCLC放化疗治疗抵抗中起着重要作用。我们进一步在耐药和敏感SCLC细胞株中进行RT-PCR验证了WES测序中获得性耐药相关的拷贝数变异表达；并在细胞实验中证实了PI3K抑制剂逆转SCLC耐药细胞株耐药的作用。.（2）采用ctDNA基因测序验证了SCLC放化疗抵抗的关键基因变异：我们收集了77例SCLC患者治疗前血浆样本，其中9例患者同时收集了疾病进展时的配对血浆样本，对这些血浆ctDNA进行了覆盖1021个肿瘤相关基因测序。我们阐明了ctDNA作为临床肿瘤组织的补充手段探索SCLC基因突变特征及监测复发的可行性。9例治疗前后配对ctDNA显示的SCLC放化疗抵抗机制与第（1）部分研究中肿瘤组织的结果一致。.（3）采用全外显子测序、TCR测序阐明了SCLC基因组学及TCR瘤内异质性（ITH）及其与患者预后的相关性：我们完成了19例手术切除SCLC肿瘤组织标本的多点活检（共50个肿瘤区域）WES及TCR测序，绘制了SCLC免疫基因组瘤内异质性结构，并分析了其与预后相关性。我们阐明了SCLC瘤内基因组学及免疫微环境异质性特征。尽管存在同质的基因组背景，SCLC表现出冷的异质性T细胞浸润，这可能导致无效的抗肿瘤免疫监测。.（4）通过前瞻性临床研究探索及阐明了局限期SCLC胸部放疗靶区及放化疗时机问题：首先，我们开展了 SCLC手术标本镜下原发灶外微浸润范围研究，该结果为局限期小细胞肺癌胸部放疗靶区勾画CTV提供了依据。同时，我们开展了一项前瞻性、随机对照研究，解决了长久以来放疗靶区的争议问题。此外，本课题组回顾分析了2个前瞻性研究中采用超分割放疗或大分割放疗的患者预后。研究发现采用超分割放疗或大分割放疗的两组患者，肿瘤局部区域控制情况及长期生存差异无统计学意义。