鸭坦布苏病毒3'非编码区功能及对病毒基因组复制影响的研究

A severe viral disease spread around the duck-producing regions in China with heavy egg drop, a flavivirus isolated from ducks as a new genotype of TMUV, a mosquito-borne flavivirus of the Ntaya virus group. The conserved sequences in the 3'NCR are universal features in flaviviruses, involved in genome cyclization, viral replication and translation, and impact on the survival and pathogenicity of the virus. To date, there have been no reports of the research on the function of Tembusu virus 3'NCR. The studies on conserved sequences in the 3'NCR was in an effort to understand the function of secondary structure of the 3'NCR and the role in RNA replication. Based on our research in analysis of the complete genome of Tembusu virus, this project will (i) predict and analysis the secondary structure of the Tembusu virus 3'NCR to determine the areas of stem-loop structure and the cis-acting elements; (ii) mutation and deletion of the different conserved sequences in the 3'NCR in a Tembusu virus infectious clone to determine the role of conserved sequences in RNA replication; (iii) using point mutations in the end of 3'NCR determine that both of the conserved bases in the 3-terminal dinucleotide 3'-CUOH of RNA positive and negative strands are required for replication of the Tembusu virus replicon.

鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类恩塔亚病毒群，该病毒是自2010年起广泛引起我国蛋鸭产蛋下降的重要病原。研究表明，某些黄病毒属病毒3'非编码区的保守序列与病毒基因组环化、影响基因组的复制和翻译以及与病毒的免疫逃避机制和致病性有关。研究坦布苏病毒3'非编码区保守序列功能有助于了解该区特定核酸序列形成的特定二级结构的功能及其在调控病毒基因组复制中的作用。该课题将在对鸭坦布苏病毒全基因组特点全面分析的基础上，研究1）通过分析坦布苏病毒3'非编码的保守区域预测该区可能形成茎环结构及该区存在的顺式作用元件。2）构建病毒传染性克隆将不同的保守区域进行缺失和突变，评价各保守区域在影响病毒基因组复制中的作用。3）通过对可能含有的复制相关蛋白识别的启动子序列（3'末端的CU3'碱基）进行缺失和突变，评价该区域在影响基因组负链和正链RNA合成中的作用。以探讨病毒复制的分子机制及病毒与细胞相互作用机制

坦布苏病毒感染是2010年春季我国水禽养殖地区新发生的一种传染性疾病。该病发生迅速，传播速度快，发病范围广。该病严重影响蛋鸭、种鸭的生产性能，严重危害着我国水禽业的健康发展。相关研究表明黄病毒属成员非编码区形成的二级结构与病毒的复制、转录和毒力有关。本研究中我们对分离鉴定的两株水禽源坦布苏病毒进行全基因组序列测定与分析；并选取一株鸭源分离株构建感染性克隆和病毒拯救，为研究病毒基因组结构和功能、病毒编码蛋白功能和分子致病机理提供技术支持；利用建立的坦布苏病毒反向遗传操作平台和融合PCR技术，对3’端CS序列和次末端碱基进行了点突变，以探究两种结构的生物学功能。完成了20余株坦布苏病毒全基因组序列测定分析（2012-2015年分离株），结果显示，不同宿主来源的坦布苏病毒基因组结构一致，无明显的变异情况，证实了野鸟、蚊等均为坦布苏病毒传播的媒介；构建了坦布苏病毒的感染性克隆，分别采用体外转录和体内转录的方法获得了亲本株；对病毒基因组3’非编码区的CS序列和次末端碱基进行突变及突变株的拯救，获得了一系列的突变株，并进行了病毒增殖曲线的测定和体外致病性。构建了坦布苏病毒的感染性克隆，建立了体外转录和体内转录两种病毒拯救方法，为开展坦布苏病毒的致病机制、病毒蛋白功能等方面的研究提供了技术平台。