黑曲霉中央代谢与调控动态建模与柠檬酸高产机理研究

Modeling is an essential tool for understanding complex systems. The research on the physiological metabolism of microorganisms has stayed on descriptiveness and localization and this is due to two factors: It is difficult to measure exactly tens of millions of intracellular components, so there are no sufficient useable data; Present modeling methods can't deal with cross-Omics data and mismatch with the performance ability of computers. In the early work, we have obtained a set of time series data of transcriptome, proteome and metabolome in the industrial process of citric acid production with A.niger. A.niger can tolerate extreme condition of pH1.5 and has wide applications in enzyme, heterologous protein and citric acid. Based on preliminary work and in this project, we will do three researches. Firstly, we will develop the modeling method with intelligent computation for the dynamics of integral cell network. Supported by sets of experiment data and literature data, we utilize fuzzy logic, which needs the support of relatively less data and less parameters and which can finely mimic nonlinear characters and have good ability in prediction, make the fuzzy models respectively for the central metabolism and regulation of A.niger, and finally make the overall model for the integral cellular dynamics. Secondly, we will develop the methodology of microbial strain optimization based on dynamic models, simulate and analyse for the mechanism of high yield for citric acid with A.niger. Thirdly, We will modify the industrial strains for citric acid by mean of metabolic engineering to verify the exactness of the model predictions. With the successful implementation of this project, it will provide persuasive method and case for applying cross-Omics data to elucidate the law of life phenomena.

模型化是理解复杂系统的必要工具。微生物生理代谢目前停留在描述性、局部化阶段，可归因于两个因素，数以千万计的胞内成分难以准确测定，模型化缺乏可用数据；现有模型化方法不能处理跨组学数据，且与计算机处理能力不匹配。在前期研究中，我们获得了黑曲霉柠檬酸工业过程成套的时间序列转录组、蛋白质组、代谢组数据。黑曲霉耐受极端pH1.5，在酶制剂、异源蛋白、柠檬酸等领域有重要应用。本项目将应用模糊逻辑发展整合型细胞网络智能建模方法，采用需要数据和参数较少、又具有较好非线性逼近和预测能力的模糊逻辑，在一定规模成套组学实验支持下，对黑曲霉的中央代谢和调控过程分别模糊模型化，建立整合细胞动力学总体模型；开发基于动力学模型的菌株设计方法，模拟分析研究柠檬酸的高产机理；通过代谢工程手段改造柠檬酸工业菌株，验证模型预测的准确性。本研究的成功实施，将为应用跨组学数据阐明生命现象规律提供有说服力的方法与案例。

黑曲霉能够在极端pH环境下进行生长和快速产生柠檬酸,还是工业酶、医用蛋白质等多种工业产品的宿主，有着广泛的工业应用。但长期以来，对于黑曲霉高产、耐受的分子基础，一直缺乏深入的理解，有很多不同的甚至相互矛盾的意见和数据。理解其高产机制，阐明黑曲霉的代谢调控瓶颈，不仅能够提升柠檬酸工业生产的效率，提供我国柠檬酸工业的竞争能力，对于细胞生命的重新设计、创造新型的细胞工厂具有重要的意义。本项目采用干湿结合的系统生物学方法对黑曲霉高产柠檬酸的机理进行研究。分别从计量学计算、组学实验、动力学建模、柠檬酸生产机理研究、代谢工程验证、系统生物学资源整理几个方面开展。①计量学方面，我们开发了从基因组规模代谢网络提取最小平衡途径算法FIND_tfSBP，开发了针对不同细胞网络类型的为提高产物产率竞争途径敲除靶点预测的系列算法ReacKnock、egKnock、RegKnock，这些都是普适的合成生物学生物设计方法。使用所开发的工具计算了黑曲霉产柠檬酸的合成途径和高产柠檬酸的竞争途径敲除靶点。②组学实验方面，项目探索了对黑曲霉开展了多时间点的转录组、蛋白组、代谢组联合组学的同步时间检测，获得了关于黑曲霉的首套联合组学实验数据。③动力学建模方面，开发了一套从合成途径的计量学相互作用关系直接映射到动力学模糊逻辑系统的建模工具，实现了生物合成途径模糊系统的核心内容即模糊规则的自动生成，从而也可适用于对其他菌株的产物合成途径进行模糊动力学建模。采用该建模工具，构建了黑曲霉柠檬酸合成途径的模糊逻辑系统，生成的模糊规则数目达到4万多条，可以在动力学层次上描述途径上的代谢物浓度、蛋白（酶）的浓度、反应速度。④柠檬酸生产机理方面，分别从基于组学实验结果和计量学计算结果两个角度，考察了黑曲霉合成柠檬酸的关键酶。⑤代谢工程验证方面，开发了不同生产性能的柠檬酸生产菌株原生质体介导的遗传操作体系，并针对柠檬酸高产菌株进行了原生质体的制备、再生与转化条件的优化，为原生质体转化及黑曲霉工业菌株改造奠定了基础。⑥最后整理了黑曲霉系统与合成生物学资源，以方便未来进一步研究。通过本研究项目我们基本达到使用系统生物学方法研究黑曲霉高产柠檬酸机理的初衷目的。同时也可以说明，利用精心设计的实验获取精准的系统水平上的定量数据，利用合适的计算方法，能够理解生命调控的基本规律，指导对生命活动的改造和优化。