腐霉（Pythium）高产EPA代谢调控机理研究

花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等多不饱和脂肪酸(PuFAs)具有重要生理功能，市场供不应求，微生物发酵是生产PuFAs首选途径，AA、DHA已实现产业化，但EPA产量较低，离产业化尚有距离。本课题组获得了一株EPA产量高于目前国内外报道最高水平的腐霉菌株，该菌株具有油酸、亚油酸含量较高等特点，若将油酸和亚油酸转化为EPA，可实现EPA高产腐霉发酵。本课题拟通过EPA合成途径关键酶基因克隆、强启动子及多拷贝的多价载体构建、农杆菌介导丝状真菌转化、基因表达Q-PCR监测、脂肪酸代谢组GC-MS分析等技术集成，阐明腐霉EPA合成途径限速步骤和影响关键酶的各种因素，揭示腐霉高产EPA代谢调控机理，建立EPA高产发酵调控策略，为利用代谢工程方法构建EPA高产菌株并实施EPA高效发酵代谢调控打下坚实基础，也为其他EPA菌株高产发酵以及丝状真菌代谢调控研究提供参考。

本课题前期建立了产EPA真菌的高通量筛选方法，筛选获得了较高产量的EPA菌株，通过菌种鉴定，确定其为华丽腐霉（Pythium splendens）。.通过研究影响该菌株EPA合成的各种因素，发现温度、溶解氧及油脂合成代谢调节剂等因素对EPA合成影响较大，结合GC-MS分析脂肪酸组成，揭示了该菌株EPA合成途径，发现n-6途径是其主途径，n-3途径是次要途径，且首次发现还存在特殊途径，即“∆8脱氢”途径，它是n-6途径中补充途径。同时，还发现其n-3途径与已报道的不同，具有特有的成分20:3Δ11,14,17及∆8脱氢酶。采用直接添加外源脂肪酸底物对所确定的EPA合成途径进行分析，进一步发现EPA合成途径限速步骤及其关键酶为Δ12、Δ6及Δ17脱氢酶，从而揭示了该菌株中油酸、亚油酸含量较高且含有较多花生四烯酸（AA）的原因，通过关键酶基因克隆、功能验证、QRT- PCR检测及表达谱分析，进一步确证了以上限速步骤及其关键酶。.分别从华丽腐霉和高山被孢霉cDNA中克隆了Δ17和Δ12脱氢酶基因，Δ6脱氢酶基因通过转录组测序结果克隆得到。通过生物信息学软件分析，Δ12和Δ17脱氢酶基因分别与已报道的同源性高达99%、99.8%，而Δ6脱氢酶基因与已报道的同源性仅为86%，确定为新基因，并通过转入酵母表达进行了功能验证；还发现Δ6和Δ17脱氢酶基因均存在3个组氨酸保守区HXXXH、HXXHH和Q/HXHH，且Δ6脱氢酶基因的氨基酸序列含有一个细胞色素b5结构域。.建立并优化了农杆菌介导华丽腐霉遗传转化体系，同时建立了基因枪法转化华丽腐霉的条件。构建了含构巢曲霉强启动子Trpc的Δ6、Δ12和Δ17脱氢酶基因的pCAMBIA1303单价表达载体及Δ6、Δ5脱氢酶和E6延长酶三价表达载体，转化华丽腐霉结果表明，基因拷贝数增加可促进底物油酸、亚油酸及AA等中间产物转化，从而增加EPA积累；构建了双拷贝Δ6脱氢酶基因的pAO815酵母表达载体，转化酵母结果表明，双拷贝较单拷贝增加了Δ6脱氢酶表达，促进了亚油酸转化。 .本课题完成了计划任务，到达了预期目标。确定了华丽腐霉EPA合成途径及其限速步骤对应的关键酶；揭示了高产EPA合成调控机理，为EPA高产菌构建提供了理论和实验依据。