新型靶向融合蛋白CPL的构建及其增强乙肝DNA疫苗免疫效应的研究

DNA immunization shows great potential in therapeutic vaccination in HBV persistent infection. But difficulties in DNA targeting and expression in antigen presenting cells（APCs） represent a major limitation for efficient DNA vaccination, especially in large animals. In this project, genetic engineering will be used to design and produce the CTLA4-polylysine fusion protein(CPL) consisting of mouse CTLA4Ig linked to polylysine residues, and its biological features will be characterized by electrophoresis and flow cytometry. Thereotically, CTLA4-polyLysine fusion protein is able to function as a gene carrier system to target antigen gene vaccine to APCs via the interaction between CTLA-4 and B7 on APCs. Its effect on enhancing immune response, especially cellular response,will be studied in vivo.The CPL and HBV DNA vaccine complex will be applied to immunize normal mice and HBV transgenic mice. Humoral and cellular immune responses will be analyzed to study its enhancement on anti-HBV immune response of an HBV DNA vaccine.Furthermore, the mechanism of its enhancement on DNA vaccine potency will be also studied. The potential application of CPL in the the treatment of chronic HBV infection will be demonstrated in this study . The development of this new APCs-targeted fusion protein might provide a promising gene-targeting strategy for DNA vaccination.

DNA疫苗在慢性HBV感染的免疫治疗中展示了良好的应用前景，但其在大动物中的免疫效力不强，靶向性问题亟待解决。本课题利用CTLA-4与抗原提呈细胞（APCs）表面的 B7分子具有高亲和力的结合，以及带正电荷的多聚赖氨酸能吸附带负电荷的质粒DNA的特点，设计了一个将CTLA4Ig与多聚赖氨酸融合的新型靶向融合蛋白CPL，该融合蛋白具有吸附和携带质粒DNA靶向APCs的能力。在此我们将首先采用分子克隆、蛋白纯化等技术，获得大量具有生物活性的新型靶向融合蛋白CPL， 在体外验证其吸附和携带质粒DNA靶向至APCs的能力；然后将其与DNA疫苗联合免疫正常和HBV转基因小鼠，研究靶向融合蛋白CPL对乙肝DNA疫苗的免疫增强和治疗效应；最后我们还将对该融合蛋白的免疫增强机制进行初步研究，探讨CPL作为新型靶向分子在慢性持续性HBV感染中免疫治疗的应用前景，为DNA疫苗免疫提供新的靶向策略。

研究背景：DNA疫苗能十分有效地诱导出强大的细胞免疫，因而在慢性HBV感染的免疫治疗中展示了良好的应用前景，但其在大动物中的免疫效力不强，靶向性问题亟待解决。研究目的：本课题利用CTLA-4与抗原提呈细胞（APCs）表面的 B7分子具有高亲和力的结合，以及带正电荷的多聚赖氨酸能吸附带负电荷的质粒DNA的特点，设计了一个将CTLA4与多聚赖氨酸融合的新型靶向融合蛋白CPL，该融合蛋白具有吸附和携带质粒DNA靶向APCs的能力。研究方法和结果：我们首先采用分子克隆技术构建了表达CTLA4胞外段和多聚赖氨酸融合的重组蛋白真核表达质粒（pmCPL），然后利用真核细胞转染技术、克隆筛选技术得到表达该融合蛋白的细胞，最后利用蛋白表达和纯化技术获得了此融合蛋白（mCPL）。 在体外我们对该融合蛋白mCPL进行了生物活性检测，利用DNA凝胶阻滞实验证实mCPL能够有效地结合质粒DNA ；DNA酶保护试验表明：mCPL和质粒DNA结合对DNA具有一定的保护作用,可以减缓其被DNA酶的消化降解；流式细胞术结果表明mCPL和B7表达细胞具有较好的结合率，因此该融合蛋白mCPL具有吸附DNA靶向APCs的能力。研究意义：此新型靶向融合蛋白的成功构建为乙型肝炎的DNA免疫治疗提供一种新的靶向策略，不仅在慢性持续性病毒感染性疾病的基因免疫治疗中具有较大的应用价值，而且也应该在其他感染性疾病、肿瘤、变态反应疾病等基因免疫治疗中具有潜在的应用前景。