急性肝衰竭治疗的新靶点APE/Ref-1及三黄茵赤胶囊的防治

急性肝衰竭是严重危害人类健康的一种疾病，病死率很高。以往对急性肝衰竭的研究着重在免疫介导的肝损伤或药物引起的肝细胞坏死方面。本项目另辟蹊径，以肝脏的氧化应激损伤为突破口，从氧化应激损伤角度，以细胞抗氧化应激的重要分子APE/ Ref-1为核心，探索氧化应激损伤在肝脏"二次打击"中的重要性。本研究以D-氨基半乳糖/内毒素大鼠急性肝衰竭、肝硬化大鼠急性肝衰竭及人肝细胞为实验模型，运用western-blot、免疫组化、mRNA原位杂交、荧光定量PCR法、细胞凋亡、形态学等方法，动态观察急性肝衰竭过程中APE/ Ref-1与氧化应激及肝损伤的关系及调节作用。观察正在进行临床前新药研究的医院制剂三黄茵赤胶囊对急性肝衰竭的防治作用。上述研究，对揭示急性肝衰竭的机制，为急性肝衰竭提供新的治疗思路和方法有较大意义。

首先，观察三黄茵赤汤防治急性肝衰竭大鼠氧化应激及肝细胞凋亡的作用。方法：48只SD大鼠随机分为正常对照组、 模型组、 三黄茵赤汤高、 中、 低剂量组、 双环醇组。给药处理5 天后，建立急性肝衰竭模型。48 h后处死动物，检测肝功能、凝血相关指标； 分析病理，检测肝脏匀浆液超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量； 免疫组化、 免疫印迹检测肝组织caspase-3表达。结果：与模型组比较， 三黄茵赤汤高、 中、 低剂量组、 双环醇组均能减少血清中AST，ALT，TBIL的含量、 缩短全血中TP, INR， 增加Fbg的含量；提高SOD活性， 减少MDA含量；下调caspase-3表达（P<0.05）。结论：三黄茵赤汤具有抗氧化的作用，可能通过抗氧化应激抑制caspase3表达从而减少肝细胞凋亡，达到防治急性肝衰竭的作用。.其次，研究三黄茵赤汤防治慢加急性肝衰竭的作用及其对APE1/Ref-1, p53、凋亡相关蛋白的调控，阐明慢加急性肝衰竭的防治机制。方法：四氯化碳联合D-氨基半乳糖和LPS建立动物模型并通过双氧水联合LPS建立细胞模型。分析大鼠生存率；检测肝脏匀浆液SOD, MDA, GSH的含量。流式细胞仪检测细胞ROS含量及细胞凋亡率。激光共聚焦显微镜观察APE1/Ref-1, p53免疫荧光原位共表达，免疫印迹、免疫组化、荧光定量PCR检测肝组织、LO2细胞亚细胞组分的蛋白和mRNA 的表达水平。结果：与模型组比较，高、中、低剂量均能减少血清中ALT, AST, TBIL, NH3的含量，缩短全血中PT, INR，增加Fbg的含量(P<0.05)；改善肝脏病理变化；提高SOD, GSH活性,减少MDA含量（P<0.05）。体内、体外实验显示，正常对照组 APE1/Ref-1主要在细胞核表达，模型组呈细胞核、浆共表达。与模型组比较，三黄茵赤汤高、中、低剂量均能显著下调APE1/Ref-1, p53在胞浆中的表达。减少细胞凋亡率，下调caspase3, Bax, 上调Bcl-2(P<0.05)。结论：三黄茵赤汤高、中、低剂量均能防治慢加急性肝衰竭，其可能机制是三黄茵赤汤的抗氧化性下调了细胞浆内APE1/Ref-1的表达从而抑制p53，调控了凋亡相关蛋白，抑制细胞凋亡达到防治慢加急性肝衰竭的作用。