基于多肽自组装的耦合增强SERS生物传感新方法及活细胞蛋白酶活性成像研究

Protease plays an important role in biological regulation and always attract a lot of interests in the field of cell research. It has been a great challenge to develop sensitive and high-throughput in situ cell detection methods for intracellular protease activity assay. Via combining the advangtanges of biosensor technology, coupling-enhanced SERS and nanoprobe technology, the project focuses on the development of novel coupling enhanced SERS-based biosensors on the basis of peptides self-assembly mediated aggregation of nanoparticles. Based on this technique, a coupling enhanced SERS-based assay method will be developed for high-sensitivity biosensing and high-resolution in situ Raman imaging of protease activity in living cells. Furthermore, such a strategy will be further applied for multiplexed detection and high-resolution imaging of protease activities in living cells. We believe that this strategy hold the potential as an efficient platform and applicable strategy for studies of cell signaling pathways, drug development and cell diagnostics.

蛋白酶具有重要的生物调控作用，在细胞体系的研究中占极重要地位。发展高灵敏、高通量的细胞内蛋白酶原位检测技术是活细胞分析领域的一项挑战性任务。本项目拟将生物传感技术、耦合增强SERS技术及纳米探针技术相结合，在探索发展基于多肽自组装介导纳米颗粒团聚的耦合增强SERS生物传感新方法的基础上，构建细胞内蛋白酶活性的高灵敏、高选择性生物传感新方法，发展高分辨的原位活细胞蛋白酶活性拉曼成像分析新技术。并更进一步构建多重的SERS纳米探针，发展细胞内多种蛋白酶的高通量检测分析方法及高分辨原位成像技术，提高细胞内蛋白酶活性分析水平，以期为相关的信号传导通路研究、药物发现、疾病诊断提供有效的技术手段和平台。

蛋白酶具有重要的生物调控作用，在细胞体系的研究中占极重要地位。发展高灵敏、高通量的蛋白酶原位检测技术是活细胞分析领域的一项挑战性任务。本项目将生物传感技术、耦合增强SERS技术及纳米探针技术相结合，探索发展了基于多肽自组装介导纳米颗粒团聚的耦合增强SERS生物传感新方法的基础上，构建了蛋白酶活性的高灵敏、高选择性生物传感新方法。并更进一步构建了多重的SERS纳米探针，发展了多种蛋白酶的同时检测分析方法，提高蛋白酶活性分析水平，以期为相关的信号传导通路研究、药物发现、疾病诊断提供有效的技术手段和平台。具体如下：.（1）本项目引入弹性蛋白酶作为模型体系，诱导纳米金通过多肽自组装引起等离子共振变化，建立了高灵敏的多肽自组装介导的耦合增强SERS生物传感新方法。本项目中运用此序列在Aβ淀粉样变性中团聚的机理，通过肽序列间的组装引起纳米金团聚，从而影响其等离子共振；AAAA是弹性蛋白酶的底物序列，AA表示它水解A(丙氨酸)与A(丙氨酸)之间的肽键；最后(PEG)8的设计是为了增加多肽的亲水性，使该多肽在酶切前后的亲疏水性有较大变化，使纳米金的团聚更加明显。通过表面增强拉曼光谱、紫外可见光谱、透射电镜及动态光散射的数据成功验证了经蛋白酶活性水解作用后，多肽自组装介导的纳米金耦合增强表面拉曼信号的增强。当弹性蛋白酶浓度在0.005U/mL到0.5U/mL范围内，浓度的对数与拉曼光谱强度呈准线性关系，该方法的检测限为0.0005U/mL。当弹性蛋白酶抑制剂在3nM到30M范围内，浓度的对数与拉曼光谱强度呈准线性关系，检测下限为1nM。.（2）进一步调查建立的蛋白酶活性的高灵敏、高选择性生物传感新方法的通用性，本项目研究了该方法用于金属基质蛋白酶7（MMP-7）的活性检测及抑制剂筛选。结果表明，建立的方法用于MMP-7的检测下限为30 pM，实现了多肽自组装介导的耦合增强SERs生物传感新方法的构建及蛋白酶活性分析应用。.（3）项目组制备弹性蛋白酶底物与DTNB共同修饰的纳米金（纳米金A）和MMP-7底物与4-MBA共同修饰的纳米金(纳米金B)，实现了蛋白酶的多组分同时分析。