N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的定向进化及其生物催化功能研究

N-deoxyribosyltransferases II (NDT) which non-specifically catalyze the transfer of deoxyribose between purine bases and/or pyrimidine bases, can be used for the preparation of a great deal of nucleoside analogues and the useful antiviral or anticancer drugs. It has been found that NDT was unstable under the condition of high concentration of substrate and solvent and could not catalyze the reactions between insoluble substrates. In this project directed evolution of NDT was firstly studied by the method of error-prone PCR and site-directed mutagenesis. By comparing the differences of the structure, activity and position of NDT residues from two types of Lactobacillus we could predetermine the positions to be mutated and the amino acids to be displaced. Then the recombinant strain with properties of high activity, high stability, high tolerance of substrates and organic solvent was got. Secondly the auto-induction system and cells Immobilization are also employed to increase the protein expression and reuse of the catalyst. Lastly, the activity and stability of mutant-NDT strain for the preparation of anticancer drug decitabine and other nucleoside analogues were studied. This project further improves the theoretical system and techniques for making deoxynucleoside analogues by the biocatalytic method and the whole-cell biocatalyst with higher stability and better tolerance were also prepared.

N-脱氧核糖转移酶II（NDT）能够催化不同碱基之间的脱氧核糖转移反应，具有高度的β-位选择性，用于制备临床广泛应用的脱氧核苷类药物及其中间体。前期基础研究表明，该酶对较高浓度的底物和溶剂耐受力弱，酶活低且不稳定，不适于催化底物水溶解性差的反应，且因终产物浓度低难于规模化应用。本课题首次采用易错PCR和定点突变相结合的方法，通过比对不同种乳酸菌NDT残基组成差异、活性和空间位置变化以及计算机辅助模拟，确定候选突变位点及替换氨基酸，定向进化改造和筛选获得活性和稳定性高、对底物和溶剂耐受力强的重组菌。其次，采用自诱导系统，抛弃价格昂贵和毒性大的IPTG，自动诱导启动子转录表达，提高酶表达量。最后，探讨NDT催化制备地西他滨和其他不同碱基类似物过程中功能参数变化规律和调控机制。课题进一步完善生物催化法制造核苷类似物的理论体系与方法，达到制备出稳定性和耐受性更佳的脱氧核苷全细胞催化剂的目的。

N-脱氧核糖转移酶 II（NDT）能够催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，可以应用于合成多种脱氧核苷类药物和中间体。NDT对2'-脱氧核苷有高度底物特异性，许多抗病毒的核苷类似物带有糖基修饰，NDT催化合成这类产物的效率极低。而且该酶对有机溶剂耐受力弱，不适于催化底物水溶解性差的反应。因此需要对酶进行突变改造，完善蛋白表达与催化反应条件，达到制备出底物识别范围更广、稳定性更强的催化剂的目的。. 本课题通过计算机辅助模拟，确定了瑞士乳杆菌来源的N-脱氧核糖转移酶 II（LhNDT）的候选突变位点，构建了LhNDT突变体库。建立了两种酶联显色筛选体系：黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶偶联体系用于随机突变体库筛选，筛选得到一株N124A突变体, 反应1h催化合成克拉屈滨的转化率降低了2.7倍以上；NDT-CDA酶联显色体系应用于饱和突变体库筛选，筛选得到一株G10S突变体，反应12h合成2',3'-二脱氧胞苷的转化率达到11.9%，是野生型NDT的5.2倍。上述结果表明NDT-CDA酶联筛选体系背景小，准确度高，可以应用于多种有医药价值的胞苷类似物催化反应的检测。在蛋白表达方面，本课题抛弃价格昂贵、毒性大的IPTG，采用自诱导培养基诱导NDT蛋白表达，使菌体密度增加了3倍左右，提高了酶表达量。在催化反应条件方面，通过全细胞非水相催化，实现了利用难溶底物催化合成核苷类似物；优化了催化条件，利用全细胞催化合成2'-脱氧胞苷、5-杂氮脱氧胞苷（地西他滨）、2'-氯-2'-脱氧腺苷（克拉屈滨）、2',3'-二脱氧胞苷（扎西他滨）等，均获得了较高的转化率。. 本研究首次建立了NDT突变体高通量筛选体系，为NDT底物特异性改造提供了有效方法；通过突变改造，大大提高了NDT对2',3'-二脱氧核苷的催化活性。使用表达NDT的全细胞制备应用广泛的核苷类似物，与传统的化学工艺相比，反应步骤少，产物立体选择性高，纯化简单；探究了非水相全细胞催化和细胞固定化条件，为NDT的工业化应用奠定了基础。