由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-III（MGAT3）催化的平分型N-糖链在骨髓造血微环境中的功能研究

The contribution of hematopoietic bone marrow microenvironment (HBMM) to hematopoiesis is far beyond our understanding. Two stromal cells derived from healthy donor (HS5 and HS27a) co-cultured with Myelodysplastic syndrome (MDS) cells are commonly used for investigation of the crosstalk between HBMM and hematopoietic stem cells during the development of MDS. Our data have shown HS27a, but not HS5, is able to facilitate proliferation of clonal cells from patients with MDS in NSG mice when those cells are co-administrated. Our preliminary data suggested that the expression of MGAT3 gene，which encodes N-acetylglucosaminyl-transferase III (MGAT3) and its product can catalyzes the synthesis of bisecting N-glycan which is involved in inhibition of tumor proliferation and metastasis, is significantly higher in HS5 than in HS27a. Our hypothesis is the bisecting N-glycan that catalyzed by MGAT3 plays an important role in interfering with the proliferation of MDS cells. Thus, we will knockdown or overexpress MGAT3 gene in those two stromal cells and co-cultured the modified cells with MDS cell lines to explore the biological function of bisecting N-glycan in regulating proliferation in MDS cells. The present proposal is aimed at obtaining additional knowledge to define the role of bisecting N-glycan in HBMM at a basic level, and to make a contribution of clinical diagnose and treatment for patients with MDS.

骨髓造血微环境的异常能导致造血功能的紊乱，但其机制仍不明确。人骨髓基质细胞HS5和HS27a与骨髓增生异常综合征（MDS）细胞的共培养模型，常被用于研究MDS中骨髓造血微环境对造血干细胞增殖、分化及凋亡的影响。申请人前期工作发现HS27a比HS5显著促进MDS细胞在小鼠体内的增殖，预实验发现催化平分型N-糖链的MGAT3在HS5细胞中的表达显著高于HS27a。平分型N-糖链能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，但在骨髓造血微环境中的功能仍未知。以此，本项目提出假设：基质细胞中由MGAT3催化的平分型N-糖链对MDS细胞增殖状态有着重要的影响。本项目通过研究MGAT3催化的平分型N-糖链对MDS细胞增殖的影响，探索MGAT3基因表达调控的分子机理，以及MGAT3和平分型N-糖链表达与MDS发展程度的相关性，以理解平分型N-糖链在骨髓造血微环境中的作用，并为MDS的临床诊断和治疗提供科学依据。

骨髓造血微环境(Hemotopoietic bone marrow microenvironments, HBMM)是造血干细胞进行自我更新并赖以生存的内环境，能够调节和维持造血干细胞的生长。造血干细胞生物学过程的调控都要紧密依赖骨髓造血微环境，它对于造血干细胞的迁移、增殖、分化、发育、衰老、凋亡发挥着重要的作用。MDS中造血微环境的异常往往伴随着基质细胞某些糖蛋白及蛋白上糖链的表达异常。蛋白质上的平分型GlcNAc修饰对细胞内信号转导、细胞黏附、细胞迁移等生物过程都有重要影响。本项目以人源骨髓基质细胞HS5和HS27a为研究对象，骨髓基质细胞与血液细胞共培养体系为模型，利用细胞生物学、分子生物学、糖生物学等技术手段，分析了HS5和HS27a细胞中负责平分型GlcNAc合成的MGAT3的表达情况，结果显示基质细胞HS5中MGAT3蛋白表达量明显高于HS27a，并且平分型GlcNAc在HS5中的表达量显著高于HS27a中的表达。通过基因工程手段在HS5中干扰MGAT3得到稳定转染株，并在HS27a中过表达MGAT3后得到稳定转染株。发现在HS27a中过表达MGAT3后与血液细胞KG1a共培养时，KG1a细胞的增殖能力降低; 而在HS5中干扰MGAT3后与KG1a细胞共培养，KG1a细胞增殖能力增强。免疫印迹分析表明细胞黏附因子MCAM与平分型GlcNAc之间存在相互作用。在干扰MGAT3后的HS5中MCAM表达量增加，而过表达MGAT3的HS27a中，MCAM表达量降低，说明基质细胞中平分型GlcNAc可能通过介导MCAM表达量来调控MDS细胞增殖能力。利用体外细胞培养技术，对骨髓增殖异常综合征（MDS）病人的骨髓基质细胞进行培养，通过细胞染色发现MDS病人骨髓基质细胞中的平分型GlcNAc水平及MGAT3的表达比正常对照组显著下降。综上所述，本项目发现修饰骨髓基质细胞中MGAT3的表达可以影响细胞中平分型GlcNAc的水平，进而对共培养体系中血液细胞的增殖有影响。本项目提出并验证了平分型GlcNAc通过影响黏附因子MCAM的表达对共培养体系中的血液细胞增殖产生影响的学术假说。