人原始生殖细胞发育过程中表观遗传学的研究

在原始生殖细胞发育过程中，DNA经历了广泛的基因的重排和甲基化变化，但DNA甲基化变化的范围和程度尚不清楚。本研究拟利用基于Molecular Inversion Probes(MIP)的重测序技术，结合人胚胎干细胞体外分化模型，观察原始生殖细胞发育过程中基因组水平的DNA甲基化变化；同时探讨let-7miRNAs在原始生殖细胞分化的过程中对DNA甲基化的调节和影响。本课题的研究结果将在基因组水平上阐述原始生殖细胞发育过程中的表观遗传学调节机制，对miRNAs与DNA甲基化的相互作用和影响作进一步探讨。

本研究主要由以下三个部分组成：.一、 对胚胎干细胞进行三维体外培养形成胚胎体，然后用BLIMP1、STELLA和SSEA1抗体对其进行免疫荧光染色，把带有这些特异性标记物的细胞分离出来进行培养。对分离培养的细胞进行鉴定，包括形成组织特异性碱性磷酸酶阳性的胚胎生殖干细胞克隆的能力、原始生殖细胞特异性基因mRNA的检测、及印记基因甲基化水平的检测。.二、 针对已公布的基因组组织和细胞特异性DNA甲基化区域，设计合成相应的全基因组MIP探针，并利用基于MIP的重测序技术在基因组水平检测和比较人胚胎干细胞及分化形成的原始生殖细胞的DNA甲基化，找出原始生殖细胞形成过程中发生特异性DNA甲基化变化的区域。同时，检测人胚胎干细胞及原始生殖细胞的基因表达谱。对比基因表达水平的变化，找出有功能的DNA甲基化区域和相应基因。.三、设计合成表达let-7 miRNAs的lentivirus载体，将载体导入胚胎干细胞中，使let-7 miRNAs在胚胎干细胞中异源性高表达。同时，设计合成了可以阻断let-7 miRNAs作用的寡核苷酸分子，用这些寡核苷酸分子对人胚胎干细胞中let-7 miRNAs进行化学阻断，观察在升高let-7 miRNAs表达水平及阻断let-7 miRNAs作用后，胚胎干细胞形成原始生殖细胞的能力。同时利用基于MIP的重测序技术，检测调节let-7 miRNAs水平前后基因组DNA甲基化的变化和基因表达谱的变化，明确let-7 miRNAs相关的DNA甲基化的变化及相应的基因调控。