匍枝根霉纤维素酶系组成解析及关键酶结构与功能研究

Rhizopus can produce a broad kind of cellulose hydrolyzing enzymes, it will be widely used in brewed industry and biomass utilization because it secret a complete system of cellulose, dextranase and amylase..In this research, on the base of previous research, we will give a systematically and functional research on the cellulases composition from a stain of Rhizopus stolonifer var. reflexus with self-independent intellectual property, which can grow on cellulose as sole carbon source，quickly produce cellulases with specific characteristics of complete composition and comprehensive substrates. Methods such as cDNA library construction, 2D-electrophoresis, enzyme activity analysis and bioinformatics research will be used. Through these research, the results such as the structure and function relationship of Rhizopus stolonifer cellulolytic enzymes, their secretome, molecular mechanism of key enzymes and their harmonize reaction will be got, so as to announce the inherence characteristic disciplinarian of Rhizopus stolonifer var. reflexus, found the base for rebuilding a system of complementary and synergistic cellulolytic enzymes with high specific activity. We hope we can offer a new basic application theory for the enzymatic cellulolytic technology and its application in the field of biomass utilization.

根霉属微生物因其具有较为广泛的纤维素底物适应性，纤维素酶、葡聚糖酶、淀粉酶等糖苷水解酶系组成齐全，具有较好的理论研究价值和在生物质资源应用前景而备受关注。.本项目在课题组前期研究的基础上，选择一株具有自主知识产权，且能以纤维素为唯一碳源、产酶速度快、底物广泛、酶系组成具有显著特点的根霉属菌匍枝根霉为出发菌株，通过构建差异cDNA文库、RT-qPCR、二维电泳分析、酶活分析、结构与功能研究及生物信息学分析方法，解析匍枝根霉纤维素酶系组成，研究酶系内各组分之间的协同作用机制，寻找关键基因并研究其结构和功能；从而揭示根霉属微生物降解纤维素所不同的内在规律。探讨重构纤维素酶系各组分互补性强、协同性好、比活力高，且快速经济的木质纤维素酶解体系，为真正实现生物质的全面利用提供理论研究基础。

为深入研究根霉属微生物所特有的酶系组成、酶结构功能关系以及纤维素水解酶的功能性质和转录调控机制，本项目在执行过程中主要完成了如下工作。. 通过cDNA文库构建和筛选，从匍枝根霉中克隆并鉴定了13条纤维素酶编码基因并利用生物信息学分析方法对纤维素酶主要组分进行了序列特征和结构建模分析，解析了各组分酶分子结构功能和催化机制之间的关联关系，为该类纤维素酶编码基因及蛋白结构信息的解析奠定了基础；结合生物信息学分析方法，利用基因工程和蛋白质工程技术实现了纤维素酶分子的结构改造和功能分析，重点探讨了酶分子中关键结构或氨基酸残基与催化功能之间的关系，研究结果可为其它有关纤维素酶的结构分析和定向进化等研究提供很好的理论依据和参考方法。. 利用RT-qPCR技术研究了BG、EG和CBH等纤维素酶编码基因在转录水平上的差异，分析了不同培养条件下匍枝根霉纤维素酶各组分合成的诱导和阻遏关系以及各组分合成变化之间的关系；纤维素酶的发酵特性研究表明匍枝根霉在5 L发酵罐中利用稻草粉发酵84 h后FPA酶活达到16.98 IU/mL，利用淀粉酶解液发酵60 h后FPA酶活达到18.87 IU/mL，与文献已报道的纤维素酶发酵工艺相比，具有发酵活力高、发酵时间短和产酶速率快等显著特点，具有良好的工业开发和应用前景。. 需特别指出的是，在纤维素酶研究领域有关葡萄糖培养条件下丝状真菌纤维素酶基因的转录调控机制这一科学问题一直未得到明确的解答。为此，本项目对研究中最新发现的一种纤维二糖合成酶（CBS）及其结构、功能和在纤维素酶基因转录调控中的作用做了全面分析，同时基于对其它诸多纤维素酶基因转录调控因子的研究结果，我们首次对匍枝根霉在葡萄糖培养条件下的纤维素酶合成机制提出了一种诱导假设模型并认为：在以葡萄糖为唯一营养碳源培养条件下，CBS作为关键调控蛋白可以葡萄糖作为前体物质在胞内自行合成纤维二糖，从而诱导一系列纤维酶基因的大量转录和表达。该模型的提出为丝状真菌纤维素酶的合成机制提供了重要理论补充和参考。