里氏木霉纤维素酶基因差异表达谱的解析及关键基因的功能分析

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）极强的纤维素酶合成、分泌能力，已成为研究纤维素酶合成代谢调控的最重要模式系统之一，但目前对该机制知之甚少。本研究拟改变以往纤维素酶表达调控研究只局限于一个或少数基因基础上的策略，从基因表达的整体水平出发，采用cDNA-AFLP技术，绘制里氏木霉在各种纤维素酶诱导因子和抑制因子存在条件下全基因组范围的基因表达谱信息。结合样本性质，分析基因表达谱的差异表现特征，通过反向NorthernR技术，鉴定差异表达基因。采用生物信息学方法分析确定与纤维素酶合成代谢相关的新的关键基因，进一步通过荧光定量PCR、足迹分析、酵母双杂交、基因敲除等技术对关键基因进行功能分析，探索它们的调控机制。该研究，一方面对阐明纤维素酶合成代谢调控的分子机制具有重要意义，同时为实施代谢工程、培育纤维素酶高产菌株提供新的合理靶点。

利用RNA-seq技术，测定了纤维素酶诱导（纤维素处理）和抑制（葡萄糖）条件下的转录谱，完成了里氏木霉纤维素酶诱导和抑制条件下差异表达谱的绘制与分析，差异显著性分析表明，相比葡萄糖而言，在纤维素培养条件下，1,387个转录本的表达丰度至少有2倍的上调，而 875个基因显著下调；建立了里氏木霉遗传转化、定向基因打靶方法、RNA干扰等里氏木霉遗传操作系统和方法；鉴定出6个对里氏木霉纤维素酶生物合成起关键性调节作用的新基因，并对其中两个TrMapk4、TrPk基因对纤维素酶高效表达调控进行了功能分析，通过基因敲除等方法对另外4个转录因子对里氏木霉纤维素酶形成的调节作用进行了分析；鉴定出2个对里氏木霉碳源利用有重要影响的运输蛋白新基因STR1、STR3，证明其为跨膜蛋白，通过对专一性单糖和寡糖的跨膜运输、对木霉纤维素酶表达调控起着重要作用。