葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的晶体结构解析及其重要B细胞表位定位研究

用X-射线晶体学解析从葎草花粉直接纯化的天然主要致敏蛋白（nHum j 3）的晶体结构。同时解析nHum j 3-鼠IgG单抗Fab片段复合物的晶体结构（已经筛选获得该单抗，保藏号：CGMCC No. 3209，与IgE识别表位重叠74%），分析其相互作用的残基以及Hum j 3蛋白的B细胞构象表位。另外，利用交叠多肽探针扫描技术分析Hum j 3蛋白的IgE线性表位。最终得到标示有重要B细胞表位的Hum j 3晶体结构。根据该晶体结构定点突变Hum j 3蛋白，经竞争抑制ELISA、表面等离子体共振、圆二色谱等验证其中影响Hum j 3与IgE/IgG结合的关键氨基酸位点，评价过敏患者T细胞对突变体的反应性，筛选具有低致敏性的Hum j 3突变蛋白。本项目将为Hum j 3蛋白的功能研究及其与抗体的相互作用机制提供结构生物学基础，为建立合适的Hum j 3分子疫苗质量标准提供理论依据。

葎草花粉是中国夏秋季花粉症的重要病因。葎草花粉主要致敏蛋白是葎草花粉症诊断和治疗的关键分子，也是标准化葎草变应原疫苗重要的质控指标。纯化的主要致敏蛋白可以有效用于花粉症的临床特异性诊断和治疗及疗效监测。本课题的主要目的是得到葎草花粉天然和重组主要致敏蛋白Humj 3的三维结构，寻找Hum j 3的重要B细胞表位,从分子水平阐述葎草花粉的致敏机制，为新一代低变应性疫苗设计和重组Humj3变应原疫苗的质量标准提供理论依据。.本课题组纯化鉴定了葎草的主要致敏蛋白全序列，命名为Humj 3。针对该主要致敏蛋白获得8个BALB/c小鼠单抗株。用抗原抗体亲和层析的方法特异性抓取葎草花粉蛋白浸液中的天然主要致敏蛋白Humj 3。比较各种抗体抓取的Humj3的纯度的收率。最后选择59号单抗大量纯化Humj 3。用梯度SDS-PAGE电泳和等点聚焦的方法验证纯度后进行结晶实验。用SPORTS技术筛选Hum j 3中与病人血清反应的B细胞表位。.本课题组通过摸索和实验，筛选到了适用于抓取较高纯度Humj 3的单抗菌株，确定了得到mg级别Humj 3的方法，纯化了大量的Humj 3，为进行X射线得到葎草花粉主要致敏蛋白Humj 3的三维结构打下了基础。也得到了与葎草花粉过敏血清池反应的Hum j 3的重要B细胞表位。