LuxR家族调控蛋白对嗜水气单胞菌在鳗鲡巨噬细胞内存活的调控及机制研究

Recent researches have found that survival in professional phagocytic cells is also one of the virulence factors of the pathogenic bacteria. However, there have only a few reports on survival in phagocytic cells of pathogenic bacteria in aquaculture, the researches on the survival mechanisms have not been carried out. In our previous studies, we found that Aeromonas hydrophila, one of the most important pathogenic bacteria in aquaculture, can survive within its host’s phagocytic cells. In this project, we will further reveal how the LuxR family regulators, one of the most important regulators for Gram-negative bacteria, work in the process of A. hydrophila survival in host’s macrophages. In-frame deletions will be performed to construct LuxR family regulators mutants, the complement strains are also generated. Survival in host’s macrophages of wild-type, mutants and complement strains will be compared. The mutants significantly impaired in survival within host phagocytic cells will be selected to sequence transcriptome along with the wild-type strain. The key genes and the metabolite networks that speculate to affect bacterial survival within host phagocytic cells will be analyzed and verified. Then, several phenotypes models will be established and compared between the mutants, the wild-type strain and the complement strains according to the results of transcriptome analysis. Comprehensively analyzing all the results, we can discuss the mechanisms of LuxR family regulators influence on the survival of Aeromonas hydrophila in fish macrophages. The results will provides new ideas and strategies for disease prevention and control in aquaculture. For the reasons above, we believe this project has important theoretical significance and practical value.

新近研究发现，在专职吞噬细胞中存活能力是很多病原菌毒力因子之一，但水产动物病原菌在吞噬细胞内存活的研究还鲜有报道，胞内存活机制的研究也尚未开展。本项目前期研究发现水产养殖业重要病原菌嗜水气单胞菌可以在宿主鱼鳗鲡的吞噬细胞内存活。因此，本项目将进一步研究革兰氏阴性菌最重要的转录调控因子之一LuxR家族调控蛋白对嗜水气单胞菌胞内存活的调控。将采用框内缺失突变技术，构建嗜水气单胞菌5个LuxR调控蛋白基因突变菌株，同时构建相应补偿菌株，通过比较野生株、突变株和补偿株的胞内存活能力，找出胞内存活能力显著变化的突变株与野生株一起进行转录组测序，分析并验证LuxR家族调控蛋白调控的关键基因和代谢通路，建立相关生物表型模型，比较突变株在这些模型中的变化，从而探讨LuxR家族调控蛋白调控嗜水气单胞菌吞噬细胞内存活的机制。研究结果必将给水产养殖业细菌性疾病的防治提供新的思路和策略，具有较高的理论和应用价值。

近年研究发现非传统意义上的胞内菌也可入侵宿主细胞，在专职吞噬细胞中存活，还可以借助吞噬细胞进一步感染和扩散。病原菌进入宿主吞噬细胞并非完全是被动吞噬的过程，而是双方互动的过程，甚至是病原菌主动侵入的过程，在吞噬细胞中生存的能力是病原菌重要的毒力因子之一。鱼类是原始的脊椎动物，其特异性免疫系统还不够完善，因此以吞噬细胞的吞噬作用为代表的鱼类非特异性免疫在对抗病原感染的过程中显得尤为重要，而病原一旦突破鱼类非特异性免疫就有可能造成严重的感染。但是水产动物非专性胞内菌在宿主细胞内存活的研究目前仅见零星报道，存活的机制还鲜有研究。.鉴于LuxR家族调控蛋白在细菌多种生理过程具有枢纽作用，本项目主要采用RNA干扰及转录组分析技术，研究6个LuxR家族调控蛋白在嗜水气单胞菌胞内存活的作用，揭示LuxR家族调控蛋白调控嗜水气单胞菌胞内存活的机制。.项目主要研究结果① 获得6个LuxR 家族调控蛋白基因表达稳定沉默的沉默株，为进一步研究这6个LuxR 家族调控蛋白的功能奠定基础；②比较6个LuxR 家族调控蛋白稳定沉默株和野生株在鱼类巨噬细胞内的存活能力，结果发现luxR05735基因沉默菌株的胞内存活能力下降67.5%，是所有菌株中胞内存活能力最差的；③ 对野生株和luxR05735基因沉默菌株进行转录组分析，结果发现二者差异表达显著的基因共1286个，基中上调基因353个，下调基因933个，差异基因KEGG富集结果主要在HIF－1信号通路及双组分系统，其中与嗜水气单胞菌胞内存活能力相关的双组份系统主要有PhoP-PhoQ、RstA-RstB、EmvZ-OmpR等。④ 综合转录组分析并验证及生物学模型建立的结果，推测LuxR05735可调控嗜水气单胞菌其他二元信号系统，从而调控细菌对吞噬细胞内低Mg2+、渗透压、抗菌肽、pH变化等信号的感应，以维持细菌在吞噬细胞内存活。.研究结果为进一步阐明非专性胞内菌在吞噬细胞内的存活机制提供理论依据，并有助于将来进一步寻找治疗病原嗜水气单胞菌的药物新靶标，给水产养殖业细菌性疾病的防治提供新的思路和策略。