嗜水气单胞菌外膜囊泡耐药机制的研究

Aeromonas hydrophila is of worldwide concern and posting serious hazard on aquaculture and human health. To date, A. hydrophila is mainly controlled by antibiotics, which leads to a significant problem of antibiotic tolerance. Studies on mechanisms of antibiotic tolerance are critical for the correct usage of antibiotics and developments of new and more effective drugs. It is very important to research the biological function and find out the specific protective immunogen of this bacterium. Recent studies reported the outer membrane vesicle (OMVs) vaccines have vital biological functions and, as a consequence of intense research, it was soon found that OMVs play important roles in bacterial physiology and pathogenesis. .In previous study, it has been found that the existance of OMVs in A. hydrophila,and the secretions and components are different in different doses of antiobiotic.In this study, composed of OMVs in A. hydrophila were compared in different kinds of antibiotics response by quantitative proteomics methods, then the strains will be constructed by delection the genes to verify their biological roles.At last, interaction map of resistance-related protein was conducted. In this way, we try to provide novel insights into the common resistance mechanisms of OMVs in A. hydrophila which response to different kinds of antibiotics and find a new strategies of fish protection against A. hydrophila.

嗜水气单胞菌是在全世界范围内流行的一种条件致病菌，给水产养殖业和人类健康带来了严重危害。抗生素是该菌的主要手段，但滥用抗生素导致了耐药性日益加重。研究该菌耐药机制对指导正确用药、发展新药具有重要意义。本项目拟以该菌分泌的具备天然自身防御和应对外界压力等重要生物学功能的外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles，OMVs)为研究对象，探究其在耐药过程中的作用。前期工作已证实该菌OMVs的存在，其分泌量及组分在不同抗生素浓度下有明显差异。本研究首先利用定量蛋白质组学技术比较嗜水气单胞菌的外膜囊泡在不同抗生素下的蛋白表达差异蛋白质组，构建外膜囊泡分泌表达图谱，筛选耐药相关蛋白；然后利用分子生物学技术构建基因缺失菌株，验证蛋白功能；最后构建蛋白互作图谱，揭示OMV耐药机制。通过本项目的研究，以期为深入了解嗜水气单胞菌外膜囊泡的生物学功能和耐药性机理，探索有效的防控新策略提供理论依据。

细菌抗生素耐药性已成为一个严重的公共卫生问题，细胞内在机制在抗生素耐药性中的作用受到广泛关注。近年来，有研究报道称革兰氏阴性菌的耐药性可能与外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）有关。然而，OMVs介导细菌耐药性的内在机制和关键蛋白组分目前仍未知晓。在本课题研究中，发现对土霉素（OXY）敏感的水产病原菌嗜水气单胞菌（OXY-S）的OMVs显著增加了OXY耐药性。更重要的是，土霉素耐药菌株（OXY-R）比敏感菌株（OXY-S）的OMVs具有更强的保护作用。因此，本研究首先利用基于DIA的定量蛋白质组学技术，纯化OXY-R和OXY-S菌株的OMVs组分(OMVsR 和OMVSS)，并比较两者之间的差异蛋白。结果显示，OMVsR 与OMVsS相比，共12种蛋白的表达发生改变，其中7种上调表达，5种下调表达；然后，利用分子生物学技术对相关基因进行的敲除和过表达菌株构建，随后的抗生素敏感实验显示icd, rpsF 和 iscS的缺失可显著增加对OXY的敏感性，而且外源添加大肠杆菌过表达的重组蛋白(rRpsF、rIcd、rIscS、rOmpA、rPepA、rFrdA和rRplQ)粗提物会促进嗜水气单胞菌的OXY耐药性，提示这些OMVs的蛋白组分在OMVs的耐药性中起重要的作用。深入研究发现FrdA蛋白的表达受10个LuxR家族调控因子的调控。进一步以其中的转录因子AHA_1581为例，研究改基因缺失后对细菌包括耐药性等的生理表型的影响，研究发现AHA_1581 的运动与胞外蛋白酶活增强、生物被膜形成能力降低，且耐受低温、卡那霉素、庆大霉素胁迫，但是对 K2Cr2O7更加敏感。进一步对野生型 嗜水气单胞菌 和ΔAHA_1581 的定量蛋白质组学分析，共鉴定到 2654 个蛋白，其中 59 个蛋白下调表达，142 个蛋白上调表达。生物信息学分析表明AHA_1581 参与调控双组分调节系统、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA 循环等细菌重要生理过程，以及细菌耐药基因和毒力因子的差异表达。以上结果表明OMVs及其重要蛋白成份在嗜水气单胞菌抗生素耐药性具有至关重要的保护作用，预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的发生和传播可能具有重要的科学意义。