亚低温经AMPK信号通路调控心肺复苏后神经元自噬的机制研究

Mild hypothermia is the important means of neuroprotection after cardiopulmonary resuscitation (CPR), but the protection mechanism is not clear. The recent studies have shown that AMPK signal pathway is the important mechanism on regulating metabolism,autophagy and apoptosis. Our previous experiments have shown that mild hypothermia can up regulate the expression of AMPK, activate neurons autophagy and reduce apoptosis after CPR, we have screened AMPK related downstream purpose gene by Q - PCR array technology and found that mild hypothermia can elevate the gene expression of HNF4α and GPAT2 in cerebral cortex. However, how mild hypothermia regulate the autophagy and apoptosis through AMPK signal pathway , the mechanism is not clear. So, we propose the hypothesis: mild hypothermia reduces neuron apoptosis and activates autophagy by promoting the expression of AMPK and the downstream genes HNF4αand GPAT2, ultimately protects neurons after CPR. Through the establishment of rats CA/CPR and neurons OGD model, we will clarify the mechanism of mild hypothermia on neuron autophagy and apoptosis by AMPK pathway after cardiopulmonary resuscitation, so as to look for new targets on neuroprotection after CPR.

亚低温治疗是心肺复苏（CPR）后脑保护的重要手段，但其保护机制尚不十分清楚。近年研究表明AMPK是调控代谢、自噬和凋亡的重要通路。我们前期的研究表明CPR后亚低温可以上调AMPK的表达，激活自噬、减少神经元凋亡。预实验我们运用Q-PCR array技术对AMPK信号通路下游相关基因进行筛选，发现亚低温可以上调HNF4α和GPAT2基因的表达。但是，亚低温是否通过AMPK信号通路调控自噬和凋亡，机制尚不清楚，因此我们提出以下假说：CPR后亚低温通过上调AMPK及其下游信号因子HNF4α和GPAT2的表达而促进神经元自噬，减少凋亡，共同发挥脑保护作用。本课题拟通过体内和体外实验，阐明CPR后亚低温通过AMPK途径调控神经元自噬的机制，为CPR后脑损伤的治疗寻找新的靶点。

心脏骤停（CA）患者自主循环恢复成功率已有显著提高，但只有少数病人能完好出院，大多数病人死于 CPR 后脑缺血缺氧及继发再灌注损伤，因此脑复苏是当前CPR 的首要任务。亚低温治疗是近年来脑损伤领域的研究热点，亚低温治疗可以减轻脑水肿、改善神经功能，但具体机制仍不甚明确。CA/CPR是一个全身缺血-再灌注的过程，此时一种细胞能量传感器，AMP活化蛋白激酶 (AMPK) 会在各种消耗细胞能量水平的条件下被激活，已有研究表明AMPK参与脑缺血后神经保护作用。预实验我们运用qPCR array技术对AMPK信号通路下游相关基因进行筛选，发现亚低温可以上调HNF4α和GPAT2基因的表达。结合GeneCards和文献分析，我们发现AMPK激活HNF4α具有明显的生物学功能。本研究表明，亚低温可以激活AMPK促进HNF4α表达，激活AMPK可显著升高神经功能缺损评分（NDS），改善大鼠记忆功能，可减少ROSC后海马CA1区神经元细胞损伤和凋亡，而抑制HNF4α可削弱AMPK的保护性作用。进一步研究发现AMPK正向调节HNF4α的表达，且AMPK可促进Bcl-2表达，抑制Bax、Caspase 3表达。构建腺相关病毒AAV-HNF4α进行CA/CPR动物模型，结果表明HNF4α过表达可显著改善大鼠记忆功能和提高NDS评分。体外实验表明AMPK通过激活HNF4α抑制凋亡改善神经元损伤，结合Chip-seq和JASPAR分析找到了HNF4α与Bcl-2下游启动子的结合位点，通过双荧光素酶实验和WB实验进一步验证HNF4α正性调节下游靶基因Bcl-2。综上所述，亚低温可以上调AMPK和HNF4α的表达，AMPK激活HNF4α直接靶向结合Bcl-2发挥抗凋亡作用，从而减轻大鼠海马CA1区神经元损伤，明确找到了HNF4α与Bcl-2的结合位点，这为治疗CA引起的脑损伤提供新的治疗靶点。