靶向RNAi阻断uPA基因表达治疗兔骨性关节炎的实验研究

尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，近年来发现其在骨性关节炎软骨降解过程中发挥着极其重要的病理作用。它不但可以直接对软骨进行降解，更为重要的是激活基质金属蛋白酶系统来发挥更为强大的软骨降解作用，因此对uPA进行抑制可能是骨性关节炎治疗中的有效途径。本研究以新西兰大白兔为研究对象，应用RNA干扰技术、病毒基因转染方法和RT-PCR技术相结合，建立可在体内、体外稳定表达的小干扰RNA(siRNA)逆转录慢病毒载体系统，靶向、高效的使兔骨关节炎模型中软骨细胞uPA基因沉默，从而验证在骨性关节炎病变过程中降低软骨降解的作用；同期以基质金属蛋白酶抑制剂治疗OA模型作为阳性对照，通过对比分析，明确uPA基因沉默技术的可靠性和高效性，为进一步应用于人骨性关节炎治疗、预防提供有效依据，探索新的思路。

本项目以新西兰大白兔OA模型为研究对象，通过构建小干扰RNA(siRNA)逆转录慢病毒载体系统，观察uPA靶向基因沉默在细胞水平和体内试验两个方面对软骨降解的作用，从而探讨uPA基因沉默治疗OA病变的实验依据和基础理论。. 课题首先进行了高效靶向uPA有效RNA干扰片段设计、筛选并测序鉴定后，进行慢病毒包装。随后通过hulth法构建OA模型，4周后培养软骨细胞，转染siRNA-NC质粒和uPA-siRNA质粒，结果siRNA-NC组软骨细胞表达uPA和MMP-3蛋白未受到影响，而uPA-siRNA组软骨细胞uPA和MMP-3蛋白表达显著降低，这一结果较同期强力霉素干扰软骨细胞表达MMP-3蛋白的作用更为明显。. 构建新西兰大白兔OA模型，在关节腔注射siRNA-NC质粒和uPA-siRNA质粒，同时进行强力霉素干预OA模型。通过大体观察、病理切片观察发现uPA-siRNA组关节软骨的破坏程度明显下降,与强力霉素组疗效相似。其软骨组织中uPA和MMP-3的表达明显低于对照组。以上结果提示通过抑制uPA在软骨组织中的表达，可明显缓解软骨降解病变，从而达到延缓OA的病变进程。. 本课题明确了uPA在OA病变中的病理作用，通过抑制软骨组织中uPA的表达水平，可明显减少软骨病变的程度。因此uPA可作为治疗OA病变的靶点，研发安全有效的uPA抑制剂对治疗OA病变具有重要意义。