数字核酸等温扩增集成流路芯片的研制

拟采用国际先进的数字PCR技术结合新颖的环介导等温扩增(LAMP,loop-mediated isothermal amplification)技术，研制集核酸提取、核酸等温扩增及精确定量检测为一体的数字多功能集成芯片系统，建立基于微流控芯片的数字核酸等温扩增（Digital-LAMP）新方法。可以直接计数核酸初始拷贝数，实现核酸绝对定量，优于常规荧光定量PCR方法。数字等温扩增集成芯片技术可以在等温条件下扩增单一拷贝的核酸，识别单碱基差异，具有特异性高、扩增速度快、交叉污染小、灵敏度高、试剂消耗少等优点。将本方法用于DNA或RNA研究，探索集成芯片上核酸等温扩增的反应动力学规律，有望在半小时甚至更短的时间内实现病原体的定性和精确定量检测及肿瘤分子遗传分析，解决目前病原体鉴定及耐药性分析时间过长的问题，同时，也为肿瘤早期分子诊断及个体化用药提供依据。

本项目首先成功研制了集核酸提取、纯化、等温扩增及检测为一体的多功能集成芯片系统，建立了基于微流控芯片的核酸等温扩增方法，实现了等温高效、特异性高的环介导等温扩增(LAMP)反应，成功用于血液和癌细胞DNA的提取、纯化及扩增检测。DNA吸附在玻璃固相萃取柱表面，随后直接被洗脱至下游的LAMP反应区，反应结束后通过反应室内荧光强度的改变情况判断扩增与否，有效地实现“样品进-结果出”的目标。全部过程在2小时内完成。这种一体化芯片具有特异性高、扩增速度快、交叉污染小、灵敏度高、试剂消耗少等优点，适于推广应用。.数字核酸扩增技术通过单分子扩增检测实现核酸绝对定量的强大功能。本项目研制了具有自主知识产权的无阀门、无动力、自吸式数字核酸等温扩增集成流路芯片，建立了基于该芯片的单分子核酸扩增检测方法，实现了数字LAMP反应，可直接计数核酸初始拷贝数，实现核酸绝对定量，定量的准确度优于常规荧光定量PCR方法。所发明的自吸式数字核酸等温扩增集成流路芯片进样十分简便，就像真空采血管一样吸入试液。应用时无需外接动力源、无微阀，使数字核酸扩增芯片从操控芯片各个功能单元的仪器中独立出来，解决了芯片与外部系统的连接问题，消除了对仪器的依赖。这种自吸式芯片数字LAMP芯片具有数字PCR和核酸等温扩增方法两者的共同优点，可以在等温条件下扩增单一拷贝的核酸，识别单碱基差异，具有特异性高、扩增速度快、交叉污染小、灵敏度高、试剂消耗少等优点。 .数字PCR的检测优势包括灵敏度、准确度、检测动态范围等都是随着分配的小室数量的增多而提高的，同时通量的提高、反应体积的减少会极大提高单分子扩增的效率和减少污染，高通量、低成本。本项目还研制了156万反应室/cm2的超高密度数字LAMP芯片，每个反应小室的体积仅仅160飞升，检测能力达到7个数量级，准确度达到了99%，该芯片的检测能力大大超过了现有的数字PCR 芯片，具有超高通量、低消耗、微型化、集成化和超大规模平行处理等方面的优势。通过对乙肝病毒HBV-DNA的数字LAMP检测，验证百万超高密度飞升级数字LAMP反应的可行性。该系统具有超高通量、低消耗、微型化、集成化和超大规模平行处理等方面的优势。数字等温扩增芯片的操作简单化、自动化、低廉化，有利于该芯片产品的产业化，该芯片为数字核酸扩增检测仪器国产化奠定良好的基础，为生命科学提供一种核酸绝对定量检测的新工具。