P2Y1受体调控阿片类诱发便秘的机制

The opioid-induced constipation (OIC) is attributed to the disorders of μ opioid receptor (MOR)-mediated colonic motility, but the effective treatment is absent. The mechanism of the OIC may be that the opioid selectively modulates the release of the high affinity neurotransmitters of P2Y1 receptor via the action of MOR, which causes the disorder of the colonic motility and induce constipation. Now our research group try to study the mechanism that MOR modulates the colonic motility via P2Y1 receptor using the conditional gene knockout mouse models by the technologies of the pharmacology and the single intracellular microelectrode recording, research the mechanism that MOR regulates the releases of ATP etc from the intestinal nerve cells by methods of the patch clamp and Bradford method for measurement of protein, explore that EM2, MOR and P2Y1 receptor etc form the neural pathway in colonic enteric nervous system (ENS) by the methods of the multiple labeling immunofluorescence, the neural tracer and the immune electron microscopy, and evaluate the relationship of both MOR and P2Y1 receptor to the colonic motility disorder of mouse with morphine-induced constipation (MIC) by the approaches of the molecular biology and the intestinal function. The intrinsic relationship and the pathogenesis of P2Y1 receptor-mediated OIC are clarified through the above studies, which contributes to the effective treatment of OIC in clinic.

阿片类制剂激活外周μ阿片受体（MOR）导致结肠运动紊乱和便秘，目前机制不明。根据本实验前期研究我们推测，阿片制剂激活结肠肠肌丛MOR，选择性调控肠神经元释放嘌呤类等递质异常，导致P2Y1等对结肠运动调节的紊乱和便秘。本项目拟利用条件性敲除P2Y1基因小鼠模型，运用药理学和单细胞内微电极记录方法，探索P2Y1介导阿片类调控结肠运动的机制；培养肠神经细胞，运用膜片钳和Bradford法蛋白测量技术，探讨MOR调控结肠神经元选择性释放嘌呤类等递质的机制；运用免疫荧光多重标记、神经示踪和免疫电镜技术勾勒MOR和P2Y1等在结肠构成的神经通路；利用吗啡诱发便秘（MIC）小鼠模型，运用分子生物学方法检测结肠内MOR和P2Y1等的改变，体内施加干预措施，通过观察大便性状、胃肠道中转比率和结肠排出时间等，评价P2Y1与MIC发生的相关性及干预P2Y1功能对便秘的疗效。为临床治疗阿片类诱发便秘提供可能途径。

目的：探讨P2Y1与OIC的相关性及P2Y1对调控阿片类诱发便秘的作用。方法：经腹腔注射MOR选择性激动剂盐酸洛哌丁胺制作OIC模型；免疫荧光组织化学观察MOR、P2Y1与内吗啡肽2（EM2）、ATP等在大鼠结肠神经细胞内的神经化学特性和形态关系；运用 Western blot及RT-PCR检测MOR、P2Y1等在结肠肌层内蛋白和mRNA表达的变化；通过体内干预P2Y1或MOR功能、电生理学方法观察P2Y1对远端结肠运动功能的调节作用。结果：①造模5 d后，OIC大鼠粪便接近呈腊肠状小碎块。②免疫荧光组织化学染色显示，在远端结肠神经细胞表面MOR、P2Y1与NeuN有共存。③RT-PCR、Western Blot结果显示，在OIC大鼠远端结肠肠肌层内，MOR的mRNA和蛋白表达增加，而P2Y1的mRNA和蛋白表达明显降低；④P2Y1受体激动剂ATP明显缓解大鼠便秘症状，与施加MOR拮抗剂纳洛酮的效果有相似性；⑤体外张力实验结果可见，MOR内源性配体EM2增强了远端结肠片段的自主性收缩，而MOR的选择性拮抗剂β-FNA抑制远端结肠片段自主性收缩。P2Y1受体激动剂ADPβS抑制远端结肠片段的自主性收缩，继续加入EM2，可缓解ADPβS作用效果；颠倒加入药物的顺序，ADPβS抑制了EM2的作用。MRS2500增强远端结肠片段的自主性收缩，但其可抑制β-FNA对远端结肠收缩的抑制效果；颠倒药物的加入顺序，β-FNA降低了MRS2500对结肠片段的作用效果。ADPβS增强β-FNA对结肠片段的抑制作用；体外电场刺激实验结果显示，EFS抑制远端结肠片段的自主性收缩，EM2可抑制EFS对远端结肠片段自主性收缩的抑制作用，继续加入β-FNA抑制了此作用效果。加入ADPβS，进一步增强了EFS对远端结肠片段自主性收缩的抑制效果，继续加入EM2可缓解此作用，但若继续加入β-FNA可增强ADPβS对EFS的抑制效果；颠倒药物的加入顺序，可见ADPβS抑制了EM2对EFS的作用。加入MRS2500抑制了EFS的作用，继续加入β-FNA可明显缓解MRS2500的作用效果；颠倒药物加入次序，可见MRS2500也降低了β-FNA对EFS的作用。结论：MOR可能通过调控结肠肠神经细胞内嘌呤类递质如ATP等的释放，进而激活平滑肌细胞表面的P2Y1，调节结肠的运动功能。