牛乳乳铁蛋白结构与促成骨功能关系研究

Bovine lactoferrin (bLF) is a kind of multi-functional proteins. However, there isn't any report on the relationship of its structure and the anobolic skeletal actions of bLF. In the present study, in the view of bioinformation technology, the amino acid sequences and structures of bLF and most of other reported proteins with osteogenesis activity will be analyzed and contrasted by several advanced softwire tools, such as T-Coffee, I-TASSER and Structural alignment, and so on. All of these studies are aiming at the determination of conserved sequences and structures related to the osteogenesis activity of bLF. Moreover, lactoferrin with different compositions (bLFx) will be prepared by remove of Fe ion, deglycosylation, and enzymatic hydrolysis, then the different contribution of Fe ion, glycosylation, and N/C-lobe for the skeletal growth-promoting action of bLF by Circular Dichroism, Isothermal Titration Calorimetry, Isoltopic Labeling, Laster Confocal Microscope, Flow CytoMeter, Fluorescence Spectroscopy, Nano LC-ESI-MS/MS, and Western blotting technologies. The combination of bioinformation technology and biochemistry technology will clarify the the structure-function relationship of bLF from the two inseparably interconnected methods. These work will sure to establish some basic theoretical foundaments for the application of bLF when it is used as a functional component in the research and development of dairy products.

乳铁蛋白(bLF)具有多种生物活性。目前对于bLF促成骨活性方面的构效关系未见报导。本研究将首先根据生物信息技术，针对bLF等大量具有该活性的蛋白质，利用T-Coffee对比分析氨基酸序列，采用I-TASSER进行结构功能预测，采用Structural alignment对比分析空间结构，进而实现保守序列和结构域锚定；同时采用脱铁、去糖基化、酶解等方式获得不同形式的bLF(bLFx)，研究bLFx发挥活性的OPN介导的胞外转运、LRP1/2介导的内吞作用以及胞内调控MAPK信号途径等过程，采用圆二色谱、等温滴定量热、放射性标记、共聚焦显微、流式细胞术等技术，研究bLF分子中Fe、糖基化、N-Lobe等对其成骨活性的不同贡献，进而阐明bLF构效关系。本项目采用生物信息学和生物化学相结合的方式，从不同角度阐明bLF的构效关系，两种方法相辅相成。该研究将为bLF在医药和食品领域的开发奠定理论基础

乳铁蛋白(bLF)具有多种生物活性。目前对于bLF促成骨活性方面的构效关系未见报导。本研究将首先将LF与具有成骨细胞增殖活性的骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）进行生物信息对比,研究表明LF的氨基酸序列与BMP蛋白具有28.56%相似性，相似部分主要集中在LF的第522-597位氨基酸，此段序列的相对分子量大约为9 kDa。此段有较高相似度的保守区域利用生物信息学软件进行理化性质、疏水性、磷酸化位点和二级结构进行预测。同时采用脱铁、去糖基化、酶解等方式获得不同形式的bLF(bLFx)，研究结果发现，在促进成骨细胞增殖方面，铁离子有抑制成骨细胞生长的作用。乳铁蛋白去糖链以后促成骨细胞增殖活性明显下降，且糖链单独存在时，并没有显著促进成骨细胞增殖的活性。利用模拟胃液水解LF，利用SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE电泳分析不同水解时间产生的LF水解片段的分子量。利用MTT法进行细胞增殖实验，比较不同时间点LF水解产物对成骨细胞增殖活性的影响，H5（5 min）能显著促进成骨细胞增殖。利用阳离子交换层析柱SP Sepharose Fast Flow（1.6×10 cm）和凝胶层析Superdex Peptide 10/300 GL（1.0 cm×300 mm）对H5进行分离纯化，分离得到2个峰，通过MTT法确定峰5-1具有较好促成骨细胞增殖活性。采用RT-PCR、Western blot、共聚焦显微和流式细胞仪等技术，研究bLF分子对其成骨活性的不同贡献，研究LRP1及CKAP4介导的内吞作用以及胞内调控MAPK信号途径等过程，研究乳铁蛋白调节成骨细胞和破骨细胞共培养体系的影响，以及对不同免疫因子的分泌影响，从而调控去势小鼠的免疫功能，通过骨免疫通路对骨重建过程进行调控，进而阐明bLF构效关系。本项目采用生物信息学和生物化学相结合的方式，从不同角度阐明bLF的构效关系，两种方法相辅相成。该研究将为bLF在医药和食品领域的开发奠定理论基础。