牦牛乳铁蛋白的构架与抗菌机理研究

Lactoferrin is a monomeric glycoprotein found in mammal colostrum, with a wide-spectrum antibacterial effect, and is important to the pup at preliminary stage of immunity. Previous reports show that lactoferrin had a different antibacterial activity in mammals and cattle’s lactoferrin had higher antibacterial activity than that of other mammals. The latest research results indicated the yak’s lactoferrin had higher antibacterial activity than that of cattle. At present, the molecular mechanism that cause the different antibacterial activity it is unknown. This project consider the binding ability between LF and cell membrane of the bacteria, and antibacterial activity of its enzymatic hydrolysate as starting point, take the cattle’s lactoferrin as reference. We will detect binding dynamics between LFs and membrane of bacteria through film binding test, determine their antimicrobial spectrum of enzymatic hydrolysate of LFs, identify frameworks of the proteins from separate sources by protein crystallography. The reasons for change LF’s antibacterial activity in molecular structure and the mechanism of antibacterial exercise will be illuminate ultimately. The study results will provide the academic base for developing antibacterial proteins with more powerful activity.

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是发现于动物初乳中具有广谱抗菌能力的单体糖蛋白，对幼体初期免疫具有重要作用。前人研究发现不同种类动物的LF蛋白抗菌能力不同，且牛LF蛋白抗菌能力优于其他哺乳动物LF蛋白，最新研究表明牦牛LF蛋白比奶牛LF蛋白具有更强的抗菌能力。目前关于LF蛋白抗菌能力差异的分子机制尚不清楚。本项目以LF蛋白与细菌细胞膜的结合能力和LF蛋白酶解产物的抗菌活性差异为切入点，选取奶牛LF蛋白为参照，通过膜结合实验测定牦牛与奶牛LF蛋白与细菌细胞膜的结合能力差异；比较两种牛LF蛋白酶解产物的抗菌活性；并利用蛋白质晶体学方法解析LF蛋白的结构差异；最终揭示LF蛋白抗菌能力差异的分子结构基础和抗菌行使机理。本项目的成功实施将为研制抗菌能力更强的活性蛋白提供理论依据。

乳铁蛋白是发现于动物初乳中具有广谱抗菌能力的单体糖蛋白，对幼体初期免疫具有重要作用。目前关于LF蛋白抗菌能力的具体分子机制尚不清楚。.克隆多个牦牛个体的LF基因，确定牦牛与奶牛该基因的差异；在牦牛初乳中对LF蛋白进行纯化；将牦牛LF蛋白在大肠杆菌中进行表达，对表达产物进行纯化；将牦牛LF蛋白在酵母的分泌液中表达。不同来源的LF蛋白经纯化后可得到纯度较高的目的产物，但是不能达到形成晶体的纯度，故未对其进行X-Ray衍射实验。.对牦牛、奶牛LF基因和其蛋白在不同组织中的表达量进行检测，发现LF基因在乳腺中的表达量是在其他组织中的上百倍；奶牛在肺脏、肝脏、胰腺和肾脏中的表达量明显高于牦牛，而牦牛在脾脏中的表达量高于奶牛；LF蛋白的表达量与其基因表达水平相一致。.检测LF蛋白和其主要抗菌多肽对不同细菌的抗菌功能，发现LF蛋白对各种细菌的抗菌能力较弱；Lfcin多肽的长度和二硫键对其抗菌功能有很大的影响；Lfampin多肽的帽子结构可以明显的增强其对各类细菌的抗菌活性；L10多肽对大肠杆菌的抗菌能力显著高于其他多肽。.采用圆二色光谱分析LF蛋白和其多肽在不同溶液中的二级结构变化，发现在SDS的临界胶束浓度时，Lfcin和Lfampin表现出明显的由β-折叠向α-螺旋变化的趋势，这种结构的变化可能是其行使抗菌功能的结构基础。.N-端胞质区（N-terminal cytoplasmic domain, NCD）是caveolin-3蛋白行使功能的重要区域。对人caveolin-3 NCD进行了表达、纯化、寡聚特性和脂质结合研究。研究发现caveolin-3 NCD单体通过氢键作用先形成稳定的二聚体；二聚体通过疏水相互作用形成颗粒状的低分子亚寡聚体；通过疏水作用和二硫键作用低分子亚寡聚体再聚合为杆状的高分子寡聚体；这种高分子聚合体不稳定，可以进行一步通过疏水相互作用聚合成更大的寡聚物而产生沉淀；与caveolin-1蛋白相似，caveolin-3蛋白通过其NCD区域可以与胆固醇发生相互作用。