实时个性化HIV-IgY抗病毒活性及机制

Due to the AIDS virus (HIV) polymorphism and variability are very prominent, whether a single vaccine or a variety of vaccines used in combination are difficult to get highly targeted, long-term effective HIV antibodies, which is difficult to get satisfactory control effect. Our study is to induce personalized HIV-IgY from egg yolks in real time. It means to obtain HIV-IgY from immunizing chicken by individualized vaccines and changing with HIV. Antibodies of HIV-IgY will be purified and qualitative analysis .The anti-HIV activity of HIV-IgY will be tested using the cell models infected by HIV. The anti-HIV mechanism of IgY will be explored by the method of time-of-addition assay, HIV-I-mediated cell fusion assay , VSV-G pseudotyped virus assay, and the techniques of ELISA, N-Page and Western blotting. The purpose of this study is to get a new real-time personalization AIDS passive immunotherapy method. It will be provoked a new AIDS revention solution.

由于艾滋病毒（HIV）多型性和变异性十分突出，无论单一疫苗还是多种疫苗联合使用均难以获得针对性强、长期有效的HIV抗体，从而难以取得满意的防治效果。本课题拟采用目标艾滋病患者的病原体制成疫苗免疫蛋鸡，从蛋鸡卵黄中提取随HIV变化而改变的抗体，制备成实时、个性化的艾滋病毒鸡卵黄抗体（HIV-IgY），并对抗体进行纯化及定性分析；应用HIV感染细胞模型体外检测个性化HIV-IgY的抗病毒活性；应用时间递加实验、HIV-1介导的细胞融合实验、VSV-G假病毒实验以及采用酶联免疫吸附实验、非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳、免疫印迹试验等技术，分析HIV-IgY与靶点蛋白间的抗病毒作用机制。本研究工作的开展旨在探索一种新的艾滋病实时个性化被动免疫治疗方案，期望给艾滋病的防治带来新的解决途径。

研究背景：艾滋病（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由艾滋病病毒感染引起的，该疾病是对人类健康最严重的挑战。HAART是治疗HIV的经典方法，但由于HIV病毒池的存在，HAAT不能完全治愈HIV。另一方面，由于抗药性、副作用、依从性、经济性等问题，HAART的使用受到限制。IgY具有不激活补体、结合力强、可以口服、稳定性好、安全性、来源容易等特点。本课题探索HIV-1-IgY（bnAbs）对HIV-1的中和作用，为其作为AIDS的被动免疫治疗或HARRT治疗的联合应用提供依据。.研究方法：以HIV-1感染性克隆pNL4-3质粒作为HIV-1抗原免疫蛋鸡，采用水稀释、硫酸铵盐析、硫酸钠盐析的方法从蛋黄中提取，纯化HIV-1-IgY。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用考马斯亮蓝G-250对HIV-1-IgY进行染色。分析了HIV-1-IgY的分子量和纯度。采用间接ELISA法检测HIV-1-IgY的滴度和变化规律，测定HIV-1-IgY的特异性，用HIV-l IIIB / TZM BL细胞指示剂系统检测特异性IgY的体外抗病毒活性。.研究结果：SDS-PAGE凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色结果显示：HIV-IgY主要由分子量约为70 KDa重链（H链）及分子量约为30 KDa的轻链（L链）组成；间接ELISA法测得在第一次免疫蛋鸡10天左右可检测到HIV1-pNL4-3 IgY抗体，第一次免疫8周后抗体效价达到峰值并在此高效价维持约4周，第11周后抗体效价开始逐渐降低；Western blot分析提取的HIV-1 IgY能特异性识别HIV-1的包膜蛋白gp41及gp120，而阴性对照组与抗原不具有免疫反应性；HIV-1-IgY体外中和病毒实验结果显示HIV-1特异性IgY能抑制pNL4-3病毒感染的TZM-bl细胞荧光素酶的表达，免疫后组在浓度为30、60、120 µg/mL时，对HIV的抑制率分别为60%、80%、97%，呈剂量-效应相关关系，免疫前组对HIV基本无效，免疫后组与对照组前组比较，差异（Bonferroni-t检验）具有统计学意义（P<0.001）。.研究结论：（1）以HIV1-pNL4-3抗原为疫苗免疫蛋鸡，获得了较高纯度与效价的HIV-1特异性IgY；（2）特异性HIV1-1- IgY能识别HIV-1病毒的包膜蛋白g