miR-15b/cdc42/p53环路在胶质瘤细胞凋亡过程中的调控机制

Apoptosis obstacles play a key role in tumorigenesis, and how to promote malignant tumor cell apoptosis is the development direction of tumor biological treatment. Several studies have linked dysregulation of miRNA with cell apoptotic process. Our data have demonstrated that miR-15b was lower in glioma tissue specimens relative to the normal brain tissues, and elevated miR-15b can induce glioma cell apoptosis significantly and cause a reduction of cdc42 expression. In addition, it is considered that cdc42 negatively regulated p53, and activation of p53 raised the miR-15b expression. Accordingly we propose a positive feedback loop, in which p53 induces expression of miR-15b which suppresses cdc42, modulate glioma cell apoptotic progression. We intend to establish miR-15b/cdc42/p53 different expression of cell model, take a serial of cell function experiments, combined with the tests of miRNA target gene validation and transcriptional regulation to deeply explore the interactive effect of miR-15b/cdc42/p53 and the mechanism of apoptosis process, preliminary elucidate the functional state of miR-15b/cdc42/p53 loop in miRNA regulation network. Furthermore, exploring and developing optimization strategy of glioma gene therapy dependent on the studies.

凋亡途径障碍在肿瘤的发生发展中起着关键作用，促进恶性肿瘤细胞凋亡是肿瘤生物治疗的发展方向。近年来诸多证据表明miRNA在肿瘤细胞凋亡途径中发挥重要作用。我们前期研究发现miR-15b在胶质瘤中低表达，上调miR-15b可诱导细胞凋亡并引起cdc42表达降低，cdc42表达负向调控p53，同时激活p53表达可引起miR-15b升高。据此我们提出假说：miR-15b、cdc42及p53之间可能是一个miRNA调控环路，三者相互作用调控胶质瘤细胞凋亡进程。本课题拟建立miR-15b/cdc42/p53不同表达状态细胞模型并进行一系列细胞功能实验，结合靶基因验证和转录调控研究，深入探讨miR-15b/cdc42/p53间相互调控关系及其在凋亡过程中的作用和机制，初步描绘出miRNA调控网络中miR-15b/cdc42/p53环路的作用模式，并在此基础上探索和开发胶质瘤基因治疗的优化策略。

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，疗效及预后差。我们在前期工作中发现一系列异常表达的miRNAs通过多通路多靶点调节一些影响胶质瘤发生发展的重要信号网络。本课题研究结果发现：（1）利用荧光定量PCR技术检测miR-15b在不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平，结果发现miR-15b在胶质瘤组织中的表达水平低于正常脑组织，在高级别胶质瘤组织中的表达水平低于低级别胶质瘤组织，且随着胶质瘤级别增而降低。过表达miR-15b抑制胶质瘤细胞的增殖，促进胶质瘤细胞凋亡，并促使细胞周期阻滞在G0/G1期。（2）Cyclin D1是miR-15b的直接靶基因。采用miRNA预测软件(TargetScan, PicTar, and miRanda) 筛选miR-15b靶基因，发现Cyclin D1、Cripto-1等基因的mRNA 3‘UTR与miR-15b存在结合位点。荧光素酶报告实验证实在Cyclin D1 的3’UTR确存在miR-15b的结合位点；在胶质瘤细胞中miR-15b可以直接靶向结合于Cyclin D1的3’UTR区域，从而抑制基因的表达。进一步研究发现胶质瘤组织中miR-15b表达水平与Cyclin D1呈负相关。Western blotting实验验证miR-15b能抑制Cyclin D1相关信号通路，过表达Cyclin D1能够回复miR-15b mimics。（3）为了分析miR-15b表达水平与胶质瘤患者临床资料的关系，按照miR-15b在胶质瘤组织的表达量分为高表达组（miR-15b表达量﹥平均值，n=44）和低表达组（miR-15b表达量﹤平均值，n=48）。结果发现miR-15b表达水平与胶质瘤级别明显相关。miR-15b低表达同样多见于KPS评分较低的患者。没有发现miR-15b表达水平与患者的年龄、性别及肿瘤位置之间存在相关性。Kaplan-Meier生存曲线表明miR-15b表达水平与胶质瘤患者生存期密切相关，miR-15b表达量高的患者生存期明显长于miR-15b表达量低的患者。此外，Cox proportional hazards model 表明miR-15b表达水平、WHO分级及KPS评分可以作为胶质瘤患者预后的独立评价指标。上述研究表明miR-15b可以作为人脑胶质瘤诊断及治疗的靶点，并可为胶质瘤患者预后判断提供依据。