p53在中华绒螯蟹生精细胞凋亡过程中作用的分子机制

Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis， is one of the important economic crustacean in China. To keep its high efficient reproduction, high quality and large number of functional sperm are quite essential.At present, no investigation has been done to elucidate the mechanism for controlling sperm quality and number during spermatogenesis of Chinese mitten crab. Though p53 was proved to be involved in the regulation of spermatogenesis by participating in spontaneous germ cell apoptosis and stress-induced germ cell apoptosis, those studies on p53 were only focusing on spermatogenesis in mammals. Whether and how p53 regulate germ cell apoptosis during spermatogensis of Chinese mitten crab hasn't been investigated, and elucidation of this problem showed a great theatrical importance and application value to future detailed clarification of spermatogenesis in this species. Our group had cloned p53 gene in the testis of Chinese mitten crab, and we also performed in vitro hybridization to detect p53 mRNA expression pattern during spermiogenesis in this species. Based on our prelimilary study, we thought that p53 may take part in the spontaneous germ cell apoptosis and stress-induced germ cell apoptosis probably occurred during the spermatogenesis of Chinese mitten crab. We hypothesized p53 probably participate in germ cell apoptosis during its spermatogenesis by regulating either extrinsic or intrinsic cell death signaling pathway.The regulation of p53 ubiquitination likely has a relative relationship with the performance of p53 in germ cell apoptosis and spermatogenesis. In this project, a series of methods will be used, including TUNEL，Annexin V analysis，gene cloning, protein expression, realtimeRT-PCR, Western blot, Immuno-electronic microscopy, caspase enzyme activity analysis，will be done to verify our hypothesis and the mechanism of germ cell apoptosis in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis.

中华绒螯蟹是我国重要的经济甲壳动物之一，在正常情况下，一定数量功能性精子的形成对该物质的繁殖至关重要。生精细胞凋亡是控制精子质量的重要途径之一，但目前动物精子质量下降是普遍问题，原因未知。尽管p53被证明通过参与自发性和诱导性细胞凋亡调控精子发生过程，但迄今大多数对该调控机制研究仅限于哺乳动物。p53是否及如何参与和调控中华绒螯蟹生精细胞的凋亡至今无人问津。本课题组已经从中华绒螯蟹精巢中克隆出p53基因，并对其mRNA表达和分布做了初步研究。在现有结果基础上，我们认为p53可能会通过内源性或者外源性细胞凋亡路径参与中华绒螯蟹生精细胞的凋亡过程，p53蛋白的泛素化调控可能和p53调节正常的精子发生及生精细胞凋亡密切相关。本项目拟用基因克隆、原位杂交、定量PCR、免疫共沉淀、免疫荧光、免疫电镜、TUNEL、Annexin V等研究技术验证上述假设，其结果将揭示中华绒螯蟹生精细胞凋亡的可能机制。

动物精子发生过程中生精细胞的凋亡机制一直是学术界关注的问题。甲壳动物成熟的精子被包裹在精荚中，成熟的精子被传送到精荚之前发生了怎样的生精细胞筛选过程我们并不知晓。甲壳动物的精子发生是否通过凋亡来调控精子的形成是我们关心的问题。本项的目的旨在部分揭示这一机制。近些年来，环境中的重金属镉(Cadmium, Cd)造成的污染严重影响了人类的生殖健康。水环境中镉污染这一环境压力是否会诱导中华绒螯蟹生精细胞凋亡以及p53是否会在凋亡过程中发挥作用是我们感兴趣的问题。我们的研究假设是: p53可能通过内源性或者外源性细胞凋亡路径参与中华绒螯蟹生精细胞的凋亡过程。经过四年的努力，我们基本完成了项目的预期目标。我们成功地克隆出p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因的全长，并通过对氨基酸序列的分析，鉴定出了p53蛋白、Caspase 3蛋白、Caspase 7蛋白、Caspase 8蛋白的结构功能域，p53蛋白保守的结构域预测该蛋白可能作为泛素化底物参与精子发生中凋亡过程；半定量PCR检测了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因在不同组织中表达量的变化，证实在精巢中p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因的存在。探索了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因在精子形成过程中的空间分布，其分布特征暗示了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因与精子发生有相关性；p53蛋白、Caspase 3蛋白、Caspase 7蛋白、Caspase 8蛋白多克隆抗体成功制备；确认了Caspase 3蛋白在组织中的存在，为后续进一步揭示我们的科学问题即p53通过内外源凋亡途径参与中华绒螯蟹精子发生凋亡过程奠定基础。与此同时，成功地克隆出日本蟳phb基因的全长，并通过对氨基酸序列的分析，鉴定出了日本蟳PHB蛋白的结构功能域；通过免疫印迹实验证实在日本蟳精巢中存在PHB蛋白，其保守的结构域预测该蛋白可能作为泛素化底物参与日本蟳精子发生中线粒体泛素化过程，这为探究甲壳类精子发生过程中细胞凋亡机制奠定基础。