血小板靶向FVIII基因治疗的血友病甲小鼠流体下的血栓形成机制及纠正效率/风险探究

Haemophilia A results from Factor VIII (FVIII) deficiency. Platelet targeted FVIII gene therapy has several merits, while the mechanism of thrombus formation by this gene therapy is not well known and the thrombotic risk of it should be evaluated. The previous reports focus on thrombotic markers based on the whole body, while the local, especially under flow, observation is rare. The risk evaluation of age-related atherosclerosis on this gene therapy is also scant. We previously found that thrombi formed under flow had hierarchical structure, and that platelet thrombus formation varied under different wall shear rates. Using the platelet targeted FVIII transgenic (Transf8) mice (mFVIII-/- hFVIII+/+) with different FVIII levels and Transf8 mice under atherosclerosis background (apoE-/- mFVIII-/- hFVIII+/+), we mean to explore the mechanism of thrombus formation, observe the hierarchical structure, and evaluate the thrombotic risk on platelet targeted FVIII expression mainly focusing on local observation of thrombi formed under flow in real time ex vivo and in vivo. Meanwhile, the extent of atherosclerosis and atherothrombosis in atherosclerosis background will be evaluated as well. We are expected to find a balance point between the haemostasis and thrombosis and to achieve an appropriate haemostasis but not an excessive thrombosis at a lowest dosage, so as to reduce the thrombotic risk. These studies will benefit the treatment of haemophilia A.

血友病甲是由FVIII缺乏所致，血小板靶向的FVIII基因治疗有诸多优点，但其血栓形成机制尚不十分清楚，血栓风险有待评估。已发表的血栓评估缺乏局部以及血流剪切力下的数据，更缺乏年龄相关的动脉粥样硬化风险的评估。我们前期发现血栓呈分层结构，不同剪切力下血栓形态各异。我们拟通过建立具有不同FVIII水平的血小板靶向FVIII转基因（Transf8）小鼠（mFVIII-/- hFVIII+/+）及动脉粥样硬化背景下的Transf8小鼠（apoE-/- mFVIII-/- hFVIII+/+）模型（1）探索Transf8小鼠血栓形成机制，实时动态地观察局部血栓的分层结构，检测不同的血管剪切率下血栓形成情况；（2）寻找收益/风险平衡点，确立安全治疗剂量范围；明确在安全剂量范围内是否会增加动脉粥样硬化程度。以期以最低FVIII表达水平的Transf8实现止血，而不形成过量血栓，有助于血友病的治疗。

目的：研究转基因小鼠模型（2bF8trans小鼠）的血凝块结构，并评估该模型在体外和体内血流下的血栓强度和稳定性。.方法：本研究建立了靶向血小板FVIII的转基因小鼠，称为2bF8trans小鼠（mFVIII-/-hFVIII + / +），其中其FVIII在血小板，由血小板中特异的IIb启动子的控制下表达。我们检测了2bF8trans小鼠剪尾出血时间和TEG（血栓弹力图）。检测了不同的剪切率下2bF8trans小鼠的血栓稳定性和血栓强度。观察了2bF8trans小鼠在穿刺损伤的颈静脉、FeCl3损伤颈动脉以及激光损伤的提睾肌小动脉中形成的血栓的结构。野生性小鼠（WT）和血友病甲小鼠（FVIIInull）作为对照组。.结果：2bF8trans小鼠血小板的FVIII表达水平为1.39±0.24 mU / 108血小板。 2bF8trans小鼠表现出与WT小鼠相似的出血时间和血栓弹性图。在主要发生生理止血的动脉或小动脉剪切率下，在2bF8trans小鼠中形成的血栓比在FVIIInull小鼠中形成的血栓更稳定。在较高的类动脉粥样硬化狭窄的动脉病理剪切率下， 2bF8trans小鼠的血栓很难形成。因此，2bF8trans小鼠具有止血能力，但可避免病理性血栓形成。在穿刺所致颈静脉损伤部位，与WT小鼠的血小板/纤维蛋白（platelet/fibrin）均匀分布在整个血凝块中不同，2bF8trans小鼠在血栓中表现出明显纤维蛋白分布（称为“血纤维蛋白点分布”） 。在FeCl3所致的颈动脉损伤部位，血小板在血栓中广泛分布，而纤维蛋白在激活的2bF8trans小鼠中主要与活化的血小板共定位。在激光所致的提睾肌小动脉损伤部位，2bF8trans小鼠局部血栓结构很有特点，其中纤维蛋白大量沉积，血小板聚集相对较薄，其中的纤维蛋白/血小板比率较WT小鼠高。这些发现提示纤维蛋白的局部沉积可增加血凝块的机械强度，这可能是其能抵抗血液动力学冲刷的原因。.结论：在2bF8trans小鼠中形成的血栓具有特殊的局部结构，具有较高的纤维蛋白/血小板比，这对生理性剪切率下（而非病理性剪切率）血栓的稳定具有一定的作用。本研究为止血和血栓形成过程中2bF8trans小鼠血栓的形态学提供基础，有助于明确针对HA的血小板靶向FVIII基因治疗的有效性和安全性的潜在机制。