MMP9启动子去甲基化在早期糖尿病肾病足细胞表型转化中的调控作用

Phenotypic modulation of podocytes, also called epithelial to mesenchymal transition (EMT) process of podocytes, has now been the focus of study on diabetic nephropathy. Our previous study has demonstrated that persistent high expression of MMP9 had relationship with persistent EMT process of podocytes and DNA demethylation of MMP9 promoter occurred under the circumstances. The exact mechanism remains unknown. In this study, we aim to further confirm such conclusion of our preliminary experiments and determine the causal relationship between them by dual-luciferase reporter analysis. The underlying mechanism in the expression regulation has also been explored by gene silencing/overexpression adenovirus vector system of TET and further luciferase assay. This research may help to discover the mechanism of persistent EMT process of diabetic podocytes, and represent potential targets for early intervention of diabetic nephropathy.

足细胞表型转化，即上皮-间叶细胞转分化（EMT）与糖尿病肾脏病变密切相关。我们前期预实验的结果提示：MMP9持续高表达与足细胞持续EMT有关，且在该实验条件下发生了MMP9启动子去甲基化改变，其具体调控机制尚不明确。本项目拟在前期研究的基础上，进一步证实该实验结论；并且通过荧光素酶报告基因-启动子活性研究，证实MMP9启动子特异性CpG位点去甲基化改变与MMP9持续高表达的因果关系。在本研究中，我们还通过TET基因沉默/过表达慢病毒载体系统及后续的荧光素酶研究系统进一步阐明MMP9启动子去甲基化导致MMP9基因异常高表达的可能机制。本研究旨在揭示糖尿病肾病肾小球足细胞持续EMT的分子机制，为寻找阻止甚至逆转糖尿病肾病的自然病程的治疗手段提供新的实验依据。

足细胞上皮-间叶细胞转分化（Epithelial to mesenchymal transition，EMT）使足细胞表型改变，在糖尿病肾病（DN）发生发展的多个阶段发挥重要作用。DNA去甲基化导致足细胞持续高表达金属基质蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）可能与足细胞EMT过程有关。DN 中lncRNAs与EMT的关联机制目前尚不清楚。本课题通过链脲佐菌素（Streptozotocin ,STZ）诱导糖尿病大鼠模型，观察MMP9启动子去甲基化与MMP9高表达及足细胞表型转化的关系。然后通过高糖刺激足细胞的细胞模型，进一步验证MMP9启动子去甲基化与MMP9高表达及足细胞表型转化的因果关系。为探索lncRNAs在糖尿病肾病大鼠足细胞EMT中的功能，我们对糖尿病大鼠和对照大鼠的足细胞进行微阵列分析，选择了7个差异表达的IncRNAs。对足细胞进行高糖刺激，利用实时定量PCR重复验证，选择差异表达显著的lncRNA。siRNA转染下调该lncRNA水平，检测EMT相关表型蛋白的表达变化。结果显示：与对照组相比，DN模型组大鼠足细胞MMP9、α-SMA和纤维连接蛋白-1的表达显著升高，podocalyxin水平显著降低。DN大鼠中MMP9启动子CpG甲基化水平显著降低。体外细胞实验所得结果与其一致，且转染siRNA抑制MMP9表达后，人足细胞α-SMA和纤连蛋白-1的表达显著下降，podocalyxin表达显著升高。与正常对照相比，高糖处理组的第3、6、7、8和11号CpG位点表现出明显的去甲基化。MMP9启动子去甲基化可显著提高该报告基因的荧光素酶活性，提示MMP9表达受其启动子区甲基化状态的调控。实时定量PCR检测结果与微阵列数据一致，选择差异表达最为显著的lncRNA ENSRNOG00000037522，siRNA转染下调lncRNA ENSRNOG00000037522水平，PODXL1和Nephrin表达增加，α-SMAR和Vimentin表达下降。本研究证实MMP9启动子去甲基化改变可通过上调MMP9表达影响足细胞表型转化，并找到了起关键作用的CpG位点。lncRNAs在糖尿病肾病足细胞表型转化中起到了重要的调控作用。该研究为糖尿病肾病足细胞表型转化相关分子机制的深入研究及寻找新的治疗靶点提供了重要的实验依据。