一种新型大肠杆菌表达系统构建及调控机制研究

大肠杆菌表达系统仍然是研究者表达重组蛋白的首要选择。本项目基于大肠杆菌的热休克反应，以sigma 32?专门识别?的热休克蛋白启动子的保守序列为核心元件，构建成新型热激表达载体pHsh，并对其启动子和转录起始区序列进行优化，宿主菌基因进行修饰，以进一步提高系统的表达效率。选择不同的供试基因，与目前主流表达载体进行比较，证明本载体的先进性。为使系统能大规模高效应用，开发了一种大体积热激技术。此前，没有研究者利用热休克启动子构建表达载体，原因在于正常细胞内的热休克反应持续时间极短，而在携带有pHsh的细胞中，外源基因在热激启动子的控制下却能持续高效表达，本项目将用Western Blot技术，通过观察①pHsh对sigma32的影响；②pHsh对热休克负调控子Dnak 分子伴侣系统的影响；③pHsh的启动子是否保护了sigma32；揭示外源基因在热激启动子控制下能持续高效表达的机制。

大肠杆菌表达系统仍然是研究者表达重组蛋白的首要选择。本项目基于大肠杆菌的热休克反应，以sigma32专门识别的热休克蛋白启动子的保守序列为核心元件，构建成新型热激表达载体pHsh，并对其启动子和转录起始区序列进行优化，以进一步提高系统的表达效率。选择不同的供试基因，与目前主流表达载体进行比较，证明本载体的先进性。研究结果为：1. 根据sigma32所专门识别的热休克蛋白基因启动子的保守序列设计而成的热激启动子（Hsh promoter）为基础，构建了含有Hsh promoter、不依赖于p因子的GAAA终止子、SD序列、多克隆位点、来源于pUC19的高拷贝ColE1复制子、氨苄青霉素抗性基因的长为2420 bp的新型热激表达载体pHsh。.2. Western-blot实验结果表明：在热激后，带有 pHsh-xynIII 的 E.coli 细胞内的sigma32和带有pLac-xynIII 的E.coli 细胞内的sigma32一样在大约6 min 时达到最高水平，1 h 内回复到正常水平。但是不论是在诱导条件还是在非诱导条件下，带有 pHsh-xynIII 的 E.coli 细胞内的sigma 32的浓度都比带有 pLac-xynIII 的 E.coli 细胞内的sigma32的浓度要明显地更高。.3. 将嗜热菌Thermus thermophilus HB27普鲁兰酶基因TTHpu分别克隆至具有T7启动子的pET-28a和具有热激启动子的pHsh表达载体中，构建成pET-28a-pullu和pHsh-pullu重组质粒，经诱导重组酶表达，在pHsh-pullu中，重组酶活性是pET-28a-pullu的3.6倍，与pET-28a载体相比，pHsh载体可以允许细胞生长到较高的细胞密度。重组酶在pET-28a载体中目标蛋白在很大比例上以不溶性的形式存在。以普鲁兰糖为底物，发现该酶的最适温度为 70℃，最适pH为6.5。在60~70℃有很好的热稳定性，保温2h后仍然保留90%以上的酶活力，在80℃时酶活的半衰期为2h。在pH6.0~8.0的范围内酶活很稳定。Mn2+、Fe2+和EDTA等够显著增强酶的活性，其中加入终浓度为5mM Mn2+时普鲁兰酶的活力大约增加了298%。.Hsh系列热激表达载体是大肠杆菌表达系统的一种重要补充，是基因工程领域中一种重要创新。