叉头框蛋白FOXQ1调控HB-EGF/EGFR信号通路促进结直肠癌浸润转移的作用及其分子机制研究

FOXQ1 has been described promote tumor growth and metastasis in colorectal cancer (CRC); HB-EGF (heparin binding epidermal growth factor) is the ligand of EGFR (epidermal growth factor receptor), activated sHB-EGF (soluble HB-EGF) were generated by the ectodomain shedding of ProHB-EGF (membrane-anchored HB-EGF), sHB-EGF, as one ligand of the EGFR, can activate the EGFR signaling pathway. Our previous study suggests that in colorectal cancer, FOXQ1 gene positively regulate the expression of HB-EGF, and can trigger the activation of EGFR signaling pathway. However, the molecular mechanism underlying it remains unclear. In the present study, colorectal cancer cell lines in which FOXQ1 was stably knockdown or over-expression will be constructed; the role of FOXQ1 protein on expression changes and ectodomain shedding ability of HB-EGF will be elucidated by detetect HB EGF, ProHB-EGF and sHB-EGF levels by using WB, Flow cytometry and ELISA respectively; luciferase reporter system and CHIP assay will be conducted to valdiate the direct transcriptional activation of FOXQ1 on HB-EGF. HB-EGF expression levels and EGFR signaling pathways activated states will be detected by WB before and after specific HB EGF inhibitor - CRM197 or recombinant HB EGF protein have been added to stably colorectal cancer cell line in which FOXQ1 has been stably over-expressed or knockdown; In vitro and in vivo experiments will also be performed to confirme the regulational relationship of “FOXQ1→HB-EGF→EGFR signaling pathway→tumor growth and metastasis” in colorectal cancer. This study will be beneficial to supplement the regulational network of FOXQ1, and has significant research and clinical value.

FOXQ1促进肿瘤生长转移；ProHB-EGF经胞外域释放出有活性的sHB-EGF，作为EGFR的配体激活EGFR信号通路。我们的前期研究提示在大肠癌中，FOXQ1正向调控HB-EGF的表达，进而激活EGFR信号通路，但具体机制不明。本研究拟通过构建稳定高/低表达FOXQ1的大肠癌细胞株；应用WB、流式和ELISA检测HB-EGF、ProHB-EGF和sHB-EGF水平，明确FOXQ1对HB-EGF表达及胞外域释放的影响；通过荧光素酶报告系统和CHIP验证FOXQ1对HB-EGF的转录激活；WB检测在FOXQ1高/低表达组加入HB-EGF抑制剂CRM197或重组HB-EGF蛋白前后HB-EGF和EGFR信号通路激活状态改变；经体外/内实验证实大肠癌中“FOXQ1→HB-EGF→EGFR信号通路→肿瘤生长转移”这一调控关系，丰富FOXQ1在基因表达调控网络中的内容，具重要的科研和临床意义。

本研究通过构建稳定低表达FOXQ1的DLD1和SW480大肠癌细胞株；应用WB、流式和ELISA检测HB-EGF、ProHB-EGF和sHB-EGF水平，明确了FOXQ1的表达改变可能通过间接调控的方式影响大肠癌细胞sHB-EGF的水平，而对大肠癌细胞表面proHB-EGF的表达水平及其胞外域释放能力无影响；FOXQ1对sHB-EGF表达水平的调节可能是通过调控ADAM9、ADAM12和MMP-7的表达水平间接实现的，但这一间接调控作用还需进一步研究证实。通过双荧光素酶报告实验证实FOXQ1并未直接参与转录调控HB-EGF基因，FOXQ1对HB-EGF基因表达的调控可能是间接发挥作用，也可能是在大肠癌细胞中FOXQ1对这些基因的转录调控需要其他的协同信号分子来共同发挥作用。WB检测FOXQ1基因敲低前后EGFR信号通路中多个重要节点基因的表达改变，结果表明在大肠癌中，FOXQ1通过调控HB-EGF的表达改变，从而正向调控EGFR信号通路中多个重要节点基因的表达，并且FOXQ1可能通过调节AKT的磷酸化作用进而活化EGFR信号通路；人重组HB-EGF蛋白的功能回复实验进一步证实HB-EGF介导了FOXQ1基因对EGFR信号通路的调节。通过细胞增殖、克隆形成、Transwell迁移实验和划痕实验，结合加入外源人重组HB-EGF蛋白后的功能回复情况，明确了下调FOXQ1基因可抑制大肠癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力。但是，FOXQ1促进结直肠癌细胞的增殖和克隆形成的作用并不是由HB-EGF所介导的，而FOXQ1对结直肠癌细胞的浸润转移的调控作用至少部分是由HB-EGF介导的。应用含61例结直肠癌病例样本的FOXQ1和HB-EGF的IHC结果及其Kaplan-Meier生存率分析结果进一步证实，FOXQ1与HB-EGF二者阳性共表达与CRC患者的远期预后不良密切相关。本研究结果初步证实了大肠癌中“FOXQ1→HB-EGF→EGFR信号通路→肿瘤生长转移”这一调控关系，研究结果丰富了FOXQ1在基因表达调控网络中的内容。为发现抗大肠癌转移的治疗新靶点奠定了一定的实验和理论基础。