极高细胞密度下乙醇历史积累抑制毕赤酵母表达外源蛋白的分子机制及解抑制策略研究

Achieving extremely high cell density with proper glycerol feeding strategy was proven to play important role in improving recombinant protein production by methylotrophic Pichia pastoris. In our previous research, we found that the ethanol accumulation during the late glycerol feeding phase affects the expression efficiency of recombinant protein when cell density reached 160 g/L. While little information is known about the molecular mechanisms and whether proper control strategy could be developed for reducing ethanol accumulation. The objective of this research work is to explore the potential of a multi-level study integrating transcriptomic, proteomic and metabolic flux analyses as a powerful tool to comprehensively elucidate the physiological adaptation of Pichia pastoris and recombinant protein expression to the stress of ethanol accumulation. It will lead to new insights into the global mechanisms connecting protein production to environmental stress. In addition, with the help of graphic recognition based on the correlation between on-line parameter changing patterns and physiology of Pichia pastoris, an advanced and intelligent control system could be developed. This system is expected to further enhance target protein production and process stability by adaptively regulating glycerol feeding and controlling the ethanol accumulation. This study plays an important and significant role in recognizing the induction mechanism of Pichia pastoris and establishing an on-line intelligent control system for Pichia pastoris fermentation.

毕赤酵母作为宿主表达外源蛋白时，通过控制甘油流加来实现极高细胞浓度是提高外源蛋白表达水平的有效措施。我们研究发现极高细胞浓度 (干重160 g/L) 条件下，甘油流加培养后期代谢毒副产物乙醇的历史积累是影响外源蛋白水平进一步提高的关键，但其影响的机理，以及如何采取合理的发酵策略抑制乙醇的过量产生尚未阐明。本申请首先运用高通量 DNA 芯片检测技术、蛋白组学技术、代谢通量计算和过程参数多变量分析从系统生物学的层面研究甘油培养期和甲醇诱导期毕赤酵母细胞的生理状态对乙醇历史积累的响应机制。然后通过引入图形识别技术，来考察重组菌在甘油流加培养阶段、不同底物营养条件时细胞生理状态与传感器信号响应特征之间的关系，分析找出发酵调控的关键点，最终架构起发酵过程控制的模式关系，实现降低乙醇历史积累，提高外源蛋白表达效率的目标。本研究对深入认识毕赤酵母诱导启动的调控机理，建立智能型的在线自控系统具有重要意义。

重组毕赤酵母表达外源蛋白的过程通常分成甘油培养阶段和甲醇诱导表达阶段。本研究发现甘油流加培养末期乙醇的积累会抑制外源蛋白的表达，因此从转录组学角度系统分析了不同浓度乙醇胁迫条件下，毕赤酵母甘油培养期和甲醇诱导期细胞的生理状态变化。结果表明，在甘油培养期，差异表达基因的功能主要涉及蛋白质合成、能量代谢、细胞周期和过氧化物酶代谢。乙醇胁迫增加了蛋白质错误折叠的情况，降低了核糖体和线粒体的结构完整性，使得甘油流加培养末期无法得到大量具有健全功能的酵母细胞。在甲醇诱导期，与甲醇代谢、蛋白质加工合成、氨基酸代谢等途径相关的294个基因发生了显著差异表达，表明内质网胁迫不能被及时解除，破坏了细胞内的氨基酸正常代谢。为有效解除乙醇历史积累的抑制作用，进一步建立了基于乙醇在线测量的改良型自适应DO-Stat甘油流加控制策略，该策略能提高细胞比生长速率，实现极高细胞密度培养，保证后续目标蛋白的高效表达。.在甲醇诱导阶段，针对Mut+型毕赤酵母诱导水平低等问题，根据溶氧（DO）对添加等量甲醇/山梨醇的响应模式，构建了一种基于DO在线测量和模糊推理技术的甲醇/山梨醇共混流加自动控制系统。使用该控制系统，甲醇利用效率显著改善、胞内毒副中间产物的积累缓解；蛋白浓度比使用甲醇诱导策略最优批次明显提高；整体发酵性能大幅改善。针对Muts型毕赤酵母提出了一种低温 (20℃) 与甲醇/山梨醇共混组合诱导策略来优化外源蛋白的表达，该组合诱导策略同时提高了外源蛋白的表达量和发酵过程的稳定性。.诱导期培养基中甲醇浓度波动严重影响甲醇营养型毕赤酵母发酵过程的稳定性。为此提出了基于智能型模式识别的发酵故障诊断系统。在甲醇浓度不当的情况下，该系统能准确地判别出故障类型。通过补加甲醇或甘油，可以对“错误”发酵批次进行补救。