基于血浆ctDNA多基因动态定量检测的EGFR-TKI耐药机制研究

Targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) therapy in lung cancer acquires remarkable efficacy. However, the development of resistance is inevitable. T790M mutation and cMet amplification are main causes of resistance, and 40% of resistances remain unclear. To interpret resistant mechanism and characteristic of dynamic quantitative is urgent. Unlike tumor tissues, which are heterogeneity and difficult to obtain in clinic, circulation tumor DNA (ctDNA) could be monitored dynamically because of its noninvasive and homogeneity. In our previous study, not only we found many other potential resistant related markers, but also put forward a concept- abundant of EGFR mutation, which used quantitative PCR assay for dynamically detection of EGFR activate mutation, and which advanced qualitative detection to quantitative detection. To clarify how dynamic change and abundant of EGFR mutation correlate to drug resistance, we would monitor plasma T790M mutation and cMet amplification by using highly sensitive droplet digital PCR. To further find out potential mutation sequences and mechanisms of resistance based on the ctDNA genomic level, we would record exon sequence by using high-throughput next generation sequencing, and then to develop strategies overcome resistance accordingly.

针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向治疗在肺癌中疗效卓越但终将耐药，T790M突变和cMet扩增是主要耐药机制，还有40%的患者耐药机制不清，阐明耐药机制及动态量变特征是亟待解决的问题，但肿瘤组织难获得、异质性强、无法动态监测，血浆循环肿瘤DNA（ctDNA）则无创、均质、便于动态监测。本课题组前期在肿瘤组织中发现了多个潜在耐药标志物，又率先提出“EGFR突变丰度”的概念，将定性检测推进到定量检测，并采用荧光定量PCR法检测了血浆EGFR敏感突变的动态量变。本课题将采用高灵敏度微滴式数字PCR法连续定量检测血浆T790M突变和cMet扩增，阐明其动态量变特征及不同丰度基因变异的致耐药性；进而采用高通量二代测序技术对血浆ctDNA进行全外显子定量测序，发现并鉴定潜在耐药序列变异的功能，揭示其动态量变特征，从血浆ctDNA基因组水平阐明耐药机制，为制订克服EGFR-TKI耐药的策略提供依据。

EGFR-TKI治疗EGFR突变型肺癌的有效率高达70%，但终将耐药。液体活检作为组织学诊断和肿瘤活检的补充方法。在检测在检测耐药机制和肿瘤异质性中有着重要作用。本课题采用高通量二代测序和定量PCR检测EGFR突变丰度和基因谱变化。阐明其动态量变特征、不同丰度基因变异的致耐药性及单细胞水平突变异质性等，为制订克服EGFR-TKI耐药的策略提供依据。.1.发现ctDNA的疗效监测价值：对80名接受厄洛替尼或吉非替尼治疗的患者用定量PCR进行动态血浆样本分析。发现在对EGFR-TKI有最佳疗效时，L858R的含量下降至最低水平。2016年在J Hematol Oncol，第三引用本课题。首次发现两种血浆EGFR突变量的动态变化类型与EGFR-TKI的疗效有重要的相关性。.2.发现ctDNA在分析预后和耐药机制中的价值：对80例患者服用EGFR-TKI过程中的系列血浆收集和检测工作，深入分析了一代EGFR-TKI的主要耐药机制T790M在两种EGFR敏感突变类型中的分布差异以及与疗效的相关性。于2017年发表于J Thorac Oncol，第一引用本课题。提示EGFR Del19人群生存期较长与年轻患者多和T790M突变率高这两点有关；项目总结了二代测序技术勾画出的三代靶向药物艾维替尼耐药变异图谱，以及EGFR扩增在其中的独特特征、不同亚型和治疗价值，于2019年发表在EbioMedicine，第二引用本课题。项目还动态跟踪EGFR-C797S突变状态及其他潜在的耐药机制，以指导第三代EGFR-TKIs的成功再挑战。2019年发表于Science Bulletin，第四引用本课题。.3.ctDNA检测肿瘤异质性的价值：项目采用激光捕获显微切割技术对接受吉非替尼治疗的6个肺腺癌患者的120个细胞进行捕获后扩增并测序，研究结果于2019年发表于BMC Cancer，第二引用本课题。显示从单细胞水平进行突变异质性研究是可行的，EGFR激活突变的肿瘤内异质性可能与EGFR-TKIs反应有关。.本项目共发表第一标注成果3篇，第二标注成果3篇，第三标注成果1篇，第四标注成果1篇。此外培养硕士研究生4人，博士研究生2人。基于研究成果，2018年获得另一项国自然面上项目“EGFR扩增亚型诱导三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药的机制及逆转耐药研究”，使研究内容得以深入和延续。