基于NF-κB和MAPK信号通路探讨甘遂对重症急性胰腺炎肠道屏障的调控作用及分子机制

The therapeutic efficacy of severe acute psncreatitis (SAP) was greatly enhanced by the non-surgical methods of comprehensive treatment with an Euphorbia kansui. However, problems still remain. How to improve the efficacy and safety by using Euphorbia kansui, to find the potential therapeutic molecular targets, and to elucidate the possible mechanism of action in controlling the disease were less reported. A number of inflammatory mediators and signaling pathways take parts in stabilizing the intestinal mucosal barrier function, and they form an immune network to regulate the processes of SAP immune response. Based on the existing clinical and experimental results, we mainly investigated the effects of Euphorbia kansui on intestinal barrier in SAP model of rats and cells. We aimed to explore the role of the NF-kB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways in the intestinal mucosal barrier by treating with Euphorbia kansui, their relationships between regulator of PIAS1 and the downstream proteins (such as ZO-1 and occludin), and their relationships with the efficacy and prognosis of the disease. Finally, we hope more information about the therapeutic and side effects of Euphorbia kansui on intestinal mucosal barrier could be revealed by the study, and the efficacy and SAP related complications and mortality could be further improved.

目前运用甘遂辅助治疗SAP使得非手术治疗效果取得长足的进展，但依然面临诸多问题。如何安全并提高甘遂辅助治疗SAP的疗效，寻找有效的控制SAP疾病进展的分子靶标，从分子免疫学角度来探讨SAP的综合治疗仍是当今医学家们关注的热点和难点。与肠粘膜屏障功能相关的炎症信号通路是一个相互联系、相互作用，且受多种细胞因子、内毒素等激发和调控的复杂网状系统。基于已有的对甘遂、SAP肠粘膜屏障及相关的炎症信号通路的临床与基础研究，本课题拟从动物模型和细胞实验水平两方面入手，深入研究运用甘遂治疗SAP时对稳定肠粘膜屏障功能的影响；研究参与的炎症信号通路、调控因子及下游靶蛋白的活性和表达情况与疗效及预后的关系。通过探讨运用甘遂治疗SAP对肠道的保护及毒性作用的分子机制，以期在此基础上获得临床可靠的治疗SAP的分子靶标，并最终进一步提高SAP的综合治疗效果，降低败血症等恶性并发症及死亡率。

重症急性胰腺炎（SAP）病死率高，病理机制复杂。肠道作为靶器官之一，在活化中性粒细胞、促进炎症因子释放中发挥重要的作用，是SAP恶性并发症的始动因素。基于已有对甘遂、SAP肠粘膜屏障及相关的炎症信号通路的临床与基础研究，我们推断甘遂可能是通过调节肠道NF-κB及MAPK信号通路，影响肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin等的表达来发挥稳定肠粘膜屏障的功能。因此，课题组采用牛胆酸钠（NaT）逆行注射方法成功诱导出SAP模型，并且发现5%NaT组比3.5%NaT组出现更早、更严重的胰腺腺泡细胞坏死、间质水肿和出血，但仅见轻度淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润，无中性粒细胞浸润。NaT法可诱导SAP相关的肠粘膜损伤，以5%NaT组回肠绒毛脱落,坏死显著，3.5%NaT组基本没有出现。在回肠组织中，5%NaT(12h)样本可检测到IL-1β和TNF-α水平显著升高；而血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子无明显升高。上述结果提示：NaT法诱导的大鼠模型可能只是模拟了坏死性胰腺炎的发生，并未发展为细菌易位引起的脓毒症；其肠道粘膜屏障的损伤可能发生在5%NaT模型的早期阶段，系急性缺血性损伤引起的，而非细菌所致。课题组选用甘遂萜酯A（甘遂提取物）对其抗炎效应进行验证，发现甘遂萜酯A刺激RAW264.7细胞后，炎症效应分子iNOS、NO、TNF-a及IL-6表达下降，且具有浓度依耐性；COX-2无相关性，提示甘遂萜酯A具有抗炎效应，可能通过巨噬细胞发挥作用。但由于小肠IEC细胞中未能测出缝隙连接蛋白ZO-1和Occludin等的表达，课题组制备了肠道类器官作为细胞模型替代。在该模型中，可成功检测到肠粘膜屏障相关的缝隙连接蛋白ZO-1等的表达，模型符合实验要求。同时，采用体外LPS刺激巨噬细胞诱发的肠类器官损伤实验初步显示，共培养的小肠类器官结构被破坏、缝隙连接蛋白ZO-1等的表达明显减少。本课题系统评估了NaT法诱导SAP模型的发病规律，为优化选择SAP动物模型提供了实验基础；同时运用肠类器官模型探讨甘遂辅助治疗SAP可能是通过抗巨噬细胞诱发的肠粘膜损伤而起作用，对后续进一步开发SAP治疗的新药/靶向药具有重要的指导意义。