BRD4蛋白靶向降解嵌合分子（PROTACs）在多发性骨髓瘤模型中的作用机制研究

BRD4 modulates the expression of essential oncogenes such as c-Myc, and has emerged as a promising therapeutic target in diverse cancer types, including multiple myeloma（MM）. We performed pre-clinical studies of ARV825, a BRD4-specific bi-functional molecule PROTAC (proteolysis targeting chimeric molecule) which incorporates a small BRD4-binding molecule (OTX015) and an E3 ubiquitin ligase recognition moiety (cereblon) targeting BRD4 for proteasomal degradation. ARV825 led to fast, efficient degradation of BRD4 in myeloma cell lines and primary samples. Also, ARV825 decreased cellular levels c-Myc and induced cell cycle arrest and apoptosis, and reduced the viability of a panel of myeloma cell lines with greater potency than the known BRD4 inhibitors JQ1 and OTX015. We also found that ARV825 reduced the levels of downstream effectors of cereblon, IKZF1/3. Based on these results we hypothesize that enhanced anti-myeloma activity of ARV825, is in part due to combination of the effects of BRD4 degradation with the IMiD effects of pomalidomide moiety that is present in ARV825. To further investigate the molecular basis of BRD4 PROTAC antimyeloma activity, we will perform GEP and GSEA for generating a global RNA profile of the myeloma cell lines. Quantitative real-time polymerase chain reaction, Western blot, as well as Immunoprecipitation will be applied to detect the downstream targets of BRD4 and cereblon. And, BRD4 Knock down and IKZF1/3 knock down myeloma cells will be generated with shRNA for determining the role of BRD4 degradation and cereblon binding in the reduction of IKZF1/3 induced by ARV825. Also, The antimyeloma efficacy of ARV825 will be tested in a systemic xenograft myeloma model.

BRD4参与调节重要癌基因如c-Myc的表达，已成为包括多发性骨髓瘤(MM)在内多种恶性肿瘤的治疗靶点。ARV825是一种BRD4蛋白靶向降解嵌合分子（PROTAC），其包含一个BRD4结合分子OTX015以及一个E3泛素连接酶cereblon（CRBN）的识别分子。我们前期研究发现，在MM细胞, ARV825可有效的降解BRD4并下调c-Myc表达，并明显抑制细胞增殖，还明显下调CRBN下游效应分子IKZF1/3表达。因此，我们设想ARV825可能兼具BRD4抑制剂和免疫调节剂（IMiD）的双重功能。在接下来的研究中，我们将分析ARV825对MM细胞基因表达和对BRD4及CRBN下游效应分子的影响。此外，运用shRNA下调BRD4、IKZF1/3基因表达，检测ARV825的效应变化，并评估其对T细胞免疫功能的影响。然后建立系统性的MM小鼠模型以进一步检验ARV825的抗骨髓瘤作用及机制。

BRD4参与调节多种重要癌基因如c-Myc的表达，已成为包括多发性骨髓瘤(MM)在内多种恶性肿瘤的治疗靶点。BRD4 PROTACs是一类BRD4蛋白靶向降解嵌合分子（PROTAC），其包含一个BRD4结合分子以及一个E3泛素连接酶（cereblon或VHL）的识别分子，依赖蛋白酶体途径降解靶蛋白BRD4。我们的研究旨在探讨BRD4-PROTACs，ARV825及ARV763,在多发性骨髓瘤模型中的作用及相关机制。我们的研究发现，与BRD4抑制剂JQ1、OTX015相比，BRD4-PROTACs尤其是基于cereblon(CRBN)的ARV825可更有效的以时间和浓度依赖的方式抑制MM细胞增殖。该作用通过多种机制实现，如可致细胞周期阻滞，降低CDK4、CDK6表达并上调p21表达，还可诱导caspase介导的MM细胞凋亡。BRD4-PROTACs可降解BRD4蛋白并下调其下游分子c-Myc、N-Myc，还明显抑制CRBN下游效应分子Aiolos、Ikaros、IRF-4的表达。基因组学分析及蛋白组学分析提示,PROTACs除下调c-Myc信号途径外，还影响了mTOR、AKT信号途径。通过蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂（IMiDs）的干预，证实PROTACs依赖于蛋白酶体途径发挥作用，ARV825的作用还依赖于CRBN。此外，BRD4-PROTACs还可克服MM细胞对硼替佐米、来那度胺、地塞米松等多种药物的耐药，并对TP53基因敲除的MM细胞系仍保持增殖抑制作用。而在对卡非佐米耐药的RPMI8226细胞、对阿霉素耐药的RPMI8226细胞，对BRD4-PROTACs作用均不敏感。该两种耐药细胞高表达P-糖蛋白(P-gp)，在运用P-gp抑制剂维拉帕米共同作用后，BRD4-PROTACs作用明显提高。药物联合作用研究发现ARV825还和多种药物如BH3类似物、AKT抑制剂、地塞米松有协同抗骨髓瘤作用。最后，BRD4-PROTACs在原代MM细胞及MM小鼠模型均表现出抗骨髓瘤作用。综上，靶向BRD4的PROTACs在MM的临床前模型上表现出了强效抗骨髓瘤作用，为其潜在用于难治复发MM治疗的临床转化提供了前期基础。