双功能靶向蛋白水解嵌合小分子化合物的设计，合成及对雌激素受体蛋白降解机制及乳腺癌作用研究

Enhanced activation of ERα due to its protein over expression or gene mutations underlies breast cancer development and drug resistant. Thus, targeted ERα protein degradation will be the most efficient way for the treatment of breast cancer. As chemical probes Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs), which coordinate targeted protein and E3 Ubiquitin Ligase, selectively degrade targeted protein via ubiquitin proteasome system (UPS). Based on our previous results, we have achieved the SKLB-C301 that degrades estrogen receptor α (ERα) successfully (DC50=400nm), so we have initiated into simulating possible binding sites of targeted ERα and VHL with designed PROTACs, and ensuring convincible structure-activity relationship (SAR) after efficient experiments in vitro. We will achieve optimized PROTACs with novel skeleton, and molecular mechanism among ERα and VHL with PROTACs. The accomplishment of this study will afford promotive basis for innovative drugs for breast cancer eventually.

雌激素受体(ER)过度表达和/或 ER基因突变导致其活性增高，是乳腺癌发生、发展及治疗药物产生耐药性的重要因素。因此降解ER蛋白是治疗乳腺癌并解决其耐药性的有效方法。靶向蛋白水解嵌合体 (PROTACs）同时靶向目标蛋白和泛素化蛋白链接酶，通过泛素蛋白酶系统(UPS)选择性降解目标蛋白。前期工作中，我们利用计算机辅助药物设计并合成了一系列PROTACs分子，其中化合物SKLB-C301有效降解MCF-7细胞中雌激素受体ERα (DC50=400nm)。本项目通过对ERα和泛素蛋白连接酶VHL作用位点与配体的对接和模拟，对PROTACs分子进行结构优化，筛选更高活性化合物；建立体内外药效模型，研究具有指导意义的药物构效关系；探索PROTACs小分子药物与ERα蛋白和泛素蛋白链接酶VHL的降解作用机制，建立PROTACs的理论和技术基础，为乳腺癌及其他疾病药物研发提供新的途径。

本项目基于 PARP1/2 抑制剂 Olaparib 结构，设计并合成了 2 类招募 E3 泛素蛋白连接酶的 PROTACs 分子，其中招募VHL E3泛素蛋白连接酶的分子25个，招募CRBN E3泛素蛋白连接酶的分子33个。我们通过化合物对BRCA1/2突变细胞增殖抑制实验和蛋白降解实验筛选出化合物SK-575为最优的 PARP1 选择性降解剂。与阳性化合物 Olaparib 相比，SK-575对PARP1的抑制活性提高了近1倍。SK-575 抑制MDA-MB-436和Capan-1细胞增殖的 IC50 分别为19 nM 和56 nM，并且SK-575能够快速有效地降解肿瘤细胞内的PARP1蛋白，在MDA-MB-436、Capan-1和LNCaP细胞内降解 PARP1蛋白的DC50均小于10 nM，在 SW620，HCC1937、MDA-MB-468，MDA-MB-231，PC-3，22Rv细胞内降解PARP1 蛋白的 DC50达到了pM级别，最大降解Dmax > 95%，并能在作用肿瘤细胞2-4 h 即可快速降解胞内90%以上的PARP1 蛋白。与已报导的PARP1 降解剂 iRucaparib-AP5/6 相比， SK-575 降解蛋白的活性提高了10~100 倍。体外细胞凋亡和周期实验结果表明，SK-575 能有效诱导 MDA-MB-436 细胞凋亡，且能将细胞周期阻滞在G2/M 期，该结果和阳性药Olaparib 相当。除此之外， Western blot 实验表明，SK-575 在高浓度下(1-10 μM)能诱导细胞产生更多的 γH2AX 蛋白，表明在高浓度下其诱导DNA 断裂的活性强于Olaparib。小鼠体内药动学结果显示，SK-575 经腹腔注射(25 mg/kg)给药后能在体内维持一个有效的药物浓度(C8 h > 90 nM，C24 h > 12 nM)。SK-575能有效降解 SW620 小鼠肿瘤组织中的 PARP1 蛋白，在单药作用下能有效抑制 Capan-1 肿瘤生长，与顺铂或TMZ 联合用药时也表现出了较强的增敏效果，优于 Olaparib 的抗肿瘤效果。SK-575 单用未表现出明显的毒性，和化疗药联用表现出的毒性也在可接受的范围。作为PAPR1高效降解剂，该化合物有望为改善 PARP1 过度激活引起的各种疾病的治疗提供一种理想的途径。