基因组学法研究马来酰亚胺类化合物抗Sclerotinia sclerotiorum机制及作用靶标酶

Sclerotinia sclerotiorum is one of the typical fungal plant pathogens, also is a serious worldwide pathogen. Most of the present pesticides for protection and cure against it are old and easy to cause resistance. Some are toxic. The program plans to synthesize more maleimides and their derivatives to establish the chemical library of maleimide. With the compounds, the evaluation of antifungal activities against S. sclerotiorum and Saccharomyces cerevisiae. Using overexpression strains of S. cerevisiae, the antifungal mechnism will be investigated by the comparison the results of antifungal activities with the known compounds. Then the enzymes related with the mechnism in S. sclerotiorum will be separated, purificated and analyzed with the compounds to testify the antifungal mechanism of maleimides in S. sclerotiorum. Finally, the target enzyme will be purified, crystalized and its three-dimensional structure will be elucidated preliminary. The completion of the program will provide new method for the discovery of target enzyme for the antifungal agents and give new base and new idea in finding new pesticides against fungal pathogens.

菌核病是典型且严重的世界性真菌病害。目前常用的防治农药大多因使用年限长，已有较强的抗药性。项目合成制备马来酰亚胺类化合物，丰富本课题组已构建的马来酰亚胺类化合物库；研究各化合物对S. sclerotiorum和S. cerevisiae的抗菌活性；利用基因过量表达的S. cerevisiae菌株来考察加药与不加药的抗菌效果及基因表达量不同，并与数据库中常用抗菌剂基因表达量进行比对，初步分析这些化合物的抗菌机制；在此基础上，提取S.sclerotiorum相关酶，验证S.sclerotiorum抗菌机制的正确性，确定抗菌作用靶标酶；通过酶的分离纯化、单晶培养等，初步解析靶标酶及其与马来酰亚胺类化合物结合物的三维结构。项目的完成可为抗真菌农药的作用靶标酶的发现提供新方法和理论基础，同时为设计高活性和抗菌核病菌专一性强的化合物提供科学依据，为马来酰亚胺类抗真菌新型农药的创制提供科学理论基础。

含顺丁烯二酸酐结构的天然化合物，如变构霉素及其衍生物都呈现出了较好的生物活性，包括抑菌活性、植物生长调节、免疫功能调节等。然而该类天然化合物的生物活性对pH值的依赖性较大，在酸性条件下，生物活性较好，在碱性条件下，酸酐结构容易开环而降低活性，且天然化合物的种类比较单一，不易分离获得，这些都极大地限制了它们在医药上的应用。因此，通过对顺丁烯二酸酐类天然化合物的母核进行结构修饰和改造，可获得了多种高活性的抗菌化合物，特别是结构稳定，抑菌活性高，而且毒性相对较低的顺丁烯二酰亚胺结构的化合物。. 本项目合成了大量新型马来酰亚胺类化合物，并对其结构进行了表征，随后，考察了其对农业致病菌、人体致病菌、寄生虫的抑制活性以及相关化合物的细胞毒性，并对构效关系和抑菌机制进行了研究。研究结果表明，该类化合物具有很高的生物活性，经初筛和复筛，获得多个高活性化合物，具体如下所示：.（1）筛选获得17个化合物对S. sclerotiorum的抑制效果表现突出，部分化合物已完成活体实验和温室实验，进入田间试验阶段，有望进一步开发成为新型杀菌剂；.（2）筛选获得10种化合物，对R.solani的抑菌效果较好，以及5种化合物对B.cinerea的抑制活性较好，但尚需进一步进行活体实验，验证其杀菌活性和作用效果；.（3）筛选获得2个化合物，具有很好的利士曼原虫杀灭活性，其生物活性超过两性霉素B，有望开发成为新型黑热病治疗药物；.（4）针对农业线虫病活开展化合物筛选工作，筛选获得1个化合物，具有较好的杀农业线虫作用，已经入温室实验阶段，有望开发成为高效的杀农业线虫药物。. 该项目的研究结果表明，顺丁烯二酰亚胺类化合物在农业和医学方面具有广阔的应用前景，并且有相当一部分化合物的毒性低，污染小，有开发成为新型抗菌药物的潜力，这为解决人类所面临的各种流行病爆发等问题带来了希望，并且这类化合物可与多种生物酶作用，为研究该类化合物对致病菌的作用提供了理论依据。