苹果多酚通过UHRF1介导的泛素化修饰抑制乳腺癌转移的体内外研究

Metastasis is the major cause of breast cancer-related deaths. Currently, researchers focused on the relationship between ubiquitination and breast cancer metastasis. Our previous experiments conducted in MDA-MB-231 cells demonstrated that apple polyphenol could inhibit the invasion and migration in vitro, accompanying with the down-regulation of the proteins expression of DNMTS and UHRF1. UHRF1 is one E3 ubiquitin-ligase, whether the E3 ligase regulated breast cancer metastasis mediated by apple polyphneol need to be further investigated. The current project plans to elucidate the inhibitory role of apple polyphenol in breast cancer metastasis and the underlying mechanisms. Highly invasive breast cancer cell MDA-MB-231 and lowly invasive breast cancer cell MCF-7 is to be employed, and breast cancer model created from green fluorescent protein-tagged MDA-MB-231 would be also employed in vivo. The effect of apple polyphenol on metastasis inhibition would be determined by wound scratching assay and Boyden chambers in vitro after being treated by apple polyphenol for different time and at different concentration. Mammary tumor growth is to be quantified as changes in intensity and integrated density of GFP fluorescence by using the whole body fluorescence image analysis. The mechanisms would be investigated by using RT-PCR, western blot, CoIP, ubiquitination analysis. By determining the ubiquitination of UHRF1, DNMTS, MT1-MMP, integrin, TRAF2, TRAF6, IkB, bFGF, and the regulating molecular of the signalling pathway that relating to cancer metastasis, our objective is to manifest that apple polyphenol inhibits metastasis of breast cancer by affecting the auto-ubiquitination of UHRF1,which would enhance the activity of the E3 ligase, then mediating the ubiquitination of above proteins, and resulting in the inhibition of the activity and expression of MMP2/9 and tumor vessel formation. The project is to provide clues for treatment of metastatic breast cancer by using phytochemicals or by targeting E3 liagse.

转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。泛素化修饰与乳腺癌转移的关系备受关注。前期研究证实，苹果多酚可抑制乳腺癌细胞的体外侵袭和迁移，下调DNA甲基转移酶（DNMTs）和E3连接酶UHRF1的表达。UHRF1介导的泛素化是否参与苹果多酚介导的转移抑制亟待明确。本项目在体外以不同侵袭性的乳腺癌细胞为模型，在体内以MDA-MB-231/GFP接种SCID鼠为模型，证实苹果多酚的转移抑制作用，采用免疫共沉淀、体外泛素化分析、多模式小动物成像系统等，明确苹果多酚通过影响UHRF1自身泛素化，及其介导的DNMTs泛素化，使p53、p73去甲基化；UHRF1通过介导MT1-MMP，整合素，TRAF，IkB，bFGF泛素化，抑制基质金属蛋白酶2/9的活性、肿瘤血管形成及转移相关通路分子的活性，实现乳腺癌转移抑制。研究结果为将苹果多酚用于乳腺癌的辅助治疗，以及将E3泛素连接酶作为抑制乳腺癌转移的靶标提供理论基础。

肿瘤细胞的扩散和远处转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，如何有效的抑制转移，是目前乳腺癌临床治疗过程中亟待解决的问题。食物中存在植物活性成分的混合物，各成分之间可以协同发挥作用，比从食物中提取的单一成分具有更强的生物学活性。目前，膳食指南建议增加富含蔬菜、水果的消费量，因此，从营养学的角度寻求具有抑制肿瘤转移，并且低副作用的新型植物活性成分，对于控制乳腺癌的转移意义重大。.苹果多酚是含有表儿茶素，槲皮素，花青素等的混合成分，我们的前期研究证实，苹果多酚可抑制乳腺癌细胞的体外侵袭和迁移，下调 DNA 甲基转移酶（DNMTs）和具有E3连接酶活性的UHRF1的表达。泛素化修饰与乳腺癌转移的关系备受关注。UHRF1介导的泛素化是否参与苹果多酚介导的转移抑制亟待明确，特别是低浓度的、膳食中可以获得的苹果多酚混合物的浓度，在体内、外对乳腺癌转移的作用还需进一步的研究证实。.本项目在体外以侵袭性的乳腺癌细胞为实验对象，在体内以 MDA-MB-231接种的乳腺癌动物模型为研究对象，探讨苹果多酚体外、体内对乳腺癌转移作用的剂量和时间依赖性及其潜在的作用机制。体外细胞实验结果显示： 0~800ug/ml的苹果多酚作用0，24，48，72小时后可浓度依赖性的抑制细胞的增殖、侵袭和迁移，下调UHRF1的表达，以及调控细胞粘附和细胞外基质降解（MMP2，TIMP1，ARK5，CX43，GAB2和YB-1）、肿瘤新生血管形成相关分子（VEGF，bFGF）的表达水平。动物实验的结果显示：相比未进行转染的母细胞，转染UHRF1的MDA-MB-231细胞可更明显的促进肿瘤的生长以及肿瘤血管的生成；而0.3%和1%的苹果多酚干预均可抑制肿瘤的生长，并且1%苹果多酚的抑制作用更加显著；苹果多酚的干预可浓度依赖性的抑制肿瘤血管生成，以及肿瘤组织中VEGF，bFGF的表达水平，进而抑制肿瘤的转移。研究结果为将苹果多酚用于乳腺癌的辅助治疗提供了理论基础。