钙信号途径在昆虫变态发育中的功能及激素调控

The larval tissues perform programmed cell death (PCD) during metamorphosis in holometabolic insects. The steroid hormone 20-hydroxyecdysone (20E) promotes PCD and metamorphosis. We observed that 20E triggers calcium (Ca2+) increase in the cells, including intracellular calcium release from endoplasmic reticulum and extracellular calcium influx, suggesting the involvement of the calcium signaling in the 20E-induced metamorphosis and PCD. However, the evidences are short to demonstrate the function of calcium in insect metamorphosis and PCD. The involved proteins, mechanisms and hormonal regulation in the calcium signaling are unclear. Therefore, we are going to investigate the function and hormonal regulation of the calcium signaling pathway in insect metamorphosis and PCD using Helicoverpa armigera as a model. The scientific questions include: identification of the major proteins involved in 20E-induced calcium increase, the function of the calcium pathway proteins in the PCD and metamorphosis, the hormonal regulation of 20E on the calcium levels and mechanism, and the upstream factors participating in 20E-induced calcium increase. This study may demonstrate the mechanism of 20E-induced calcium increase and its role in PCD and metamorphosis, and produce new conception and enrich our knowledge in insect metamorphosis. The functional genes identified in calcium signaling may become the targets in insect control.

全变态昆虫的幼虫组织在变态发育过程中发生程序性细胞死亡，而蜕皮激素(20E)则可以促进昆虫变态及程序性细胞死亡。我们在前期研究中发现20E可以促进细胞内质网中的内钙离子释放和细胞外钙离子内流，推测钙离子信号途径参与了20E诱导的变态及程序性细胞死亡，但目前尚缺乏足够的实验证据说明钙离子信号在昆虫变态和程序性细胞死亡中的功能，对参与钙信号途径的主要蛋白、作用机理、激素调控也不清楚。因此本课题拟以棉铃虫为材料，研究钙信号途径在昆虫变态发育中的功能及激素调控, 包括鉴定参与20E调控细胞内钙离子增加的主要蛋白; 研究钙信号途径主要蛋白在昆虫变态发育及程序性细胞死亡中的功能; 分析激素对细胞内钙离子水平的调控及机理;研究钙信号途径的上游调控分子及下游效应分子，阐明蜕皮激素调控细胞内钙离子增加的分子机制及在昆虫变态发育及程序性细胞死亡中的作用，充实昆虫变态的分子机理,为害虫控制提供新的靶标基因。

钙离子(Ca2+)参与细胞各种信号传导，但Ca2+易与磷酸根形成沉淀影响蛋白质功能，因此胞浆内的Ca2+浓度在信号来临时才会增加。神经兴奋细胞通过电压门控钙通道增加Ca2+内流、非神经兴奋细胞则通过瞬时受体电位通道(TRP)和钙释放活化的钙通道(ORAI)以受体介导的方式（ROC）或钙库依赖的方式（SOC）增加细胞钙内流。昆虫变态发育中发生幼虫组织的程序性细胞死亡（PCD)，已知蜕皮激素（20E）可以促进细胞钙内流，引起细胞凋亡，但分子机制并不清楚。本课题以重大农业害虫棉铃虫为材料，研究钙信号途径在昆虫变态发育中的功能及激素调控机制, 包括鉴定参与20E调控细胞内钙离子增加的主要蛋白; 研究钙信号途径主要蛋白在昆虫变态发育及程序性细胞死亡中的功能; 分析激素对细胞内钙离子水平的调控及机理;研究钙信号途径的上游调控分子及下游效应分子。获得如下重要结果：发现20E诱导G蛋白偶联受体（GPCR）、Orai1和TRPs表达，增加细胞Ca2+水平，高浓度的Ca2+引起细胞凋亡，而JH不能诱导Orai1和TRPs上调表达，只能通过RTKs 动员低水平钙离子内流, 不能引起细胞凋亡；在变态起始期的棉铃虫中肠中，低浓度的20E诱导自噬，维持细胞存活，高浓度20E诱导自噬蛋白ATG5切割成NtATG5，活化caspase-3，促使中肠由自噬转向凋亡；20E以浓度和时间依赖的方式促进自噬相关蛋白ATG12和ATG5结合，促进棉铃虫中肠PCD, ATG12对棉铃虫中肠自噬和凋亡是必须的; 20E通过GPCRs以及磷脂酶C（PLC）促进内质网中Ca2+释放到细胞质中，胞内Ca2+的增加激活蛋白激酶PKC，促使基质相互作用因子1(STIM1)发生磷酸化，聚集并迁移到内质网-质膜结合处与Orai1相互作用，促进Ca2+内流，Ca2+促使EcRB1和USP1发生翻译后修饰，形成转录复合体结合在DNA应答元件EcRE上，起始STIM1及20E信号途径基因及凋亡基因表达，促使组织重塑和变态。本研究揭示了20E通过GPCRs介导的钙库依赖的钙离子内流（SOCE）机制促进外钙内流，高浓度的Ca2+促进20E信号途径基因表达、PCD及变态。该研究不仅阐明了20E促进钙离子内流的分子机制及生物学效应，而且为20E的GPCR信号途径的理论提供了有力的支持，为研发害虫生长调节剂提供了一批新的靶标基因。